Summary
מאמר זה מתאר את תרבות פרוסות הרקמה החולה למסירה מחקרים גנים ניתוח בדיעבד של התבטאות גנים באמצעות דימות IVIS פליטת אור.
Abstract
וידאו זה מתאר את השימוש של רקמה חולה כמודל vivo לשעבר לחקר משלוח גן. הרקמה החולה טריים שהושגו בזמן הניתוח הוא פרוס ומתוחזק בתרבות. מערכת מודל לשעבר vivo מאפשר משלוח פיזי של גנים לתוך הרקמה החולה שלם ביטוי גנים מנותח על ידי פליטת אור הדמיה באמצעות מערכת זיהוי IVIS. מערכת זיהוי bioluminescent מדגים כימות מהיר ומדויק של ביטוי גנים בתוך פרוסות בודדות ללא צורך להקריב רקמות. רקמה זו פרוסה מערכת התרבות ניתן להשתמש במגוון של סוגי רקמות כולל הרקמות וממאירים ומאפשרת לנו לחקור את ההשפעות של אופי הטרוגני של רקמות שלמות ועל רמה גבוהה של השונות בין חולים בודדים. מערכת זו יכולה לשמש מודל במצבים מסוימים כחלופה במודלים של בעלי חיים וכן במצב קליני משלימים לפני הכניסה לניסוי קליני.
Protocol
הכנת מדיה ריאגנטים
- אנטיביוטי פתרון
שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) עם 200 U / ml פניצילין, 200 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מ"ל fungizone - איסוף וטיפול בינוני
Dulbecco של הנשר שונה בינוני (DMEM) עם 200 U / ml פניצילין, 200 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מ"ל fungizone - תרבות בינוני
בינוני אוסף המכיל 10% חום מומת בסרום שור העובר
אני אוסף רקמות ואחסון
אישור עבור אוסף רקמות החולה התקבל המחקר הקליני ועדת האתיקה של בתי החולים האוניברסיטאיים קורק הסכמה מדעת התקבל החולים ביום לפני הניתוח. רקמת הכבד התקבל חולים שעברו כריתה חלקית של מחלה ממארת.
- הרקמה החולה טריים מתקבל בזמן כריתה כירורגית.
- רקמות מאוחסן אוסף המדיה ב 4 ° C (רקמות עשוי להיות מאוחסן בקירור עד 12 שעות ללא אובדן משמעותי של הכדאיות, לעומת זאת עיבוד מיידית מומלץ).
השנייה. פרוסה רקמות הכנה ותרבות
חיתוך בוצעה באמצעות vibratome (לייקה, גרמניה). מערכת חיתוך הרקמה שימש על פי הוראות היצרן. פרוסה הכנה רקמות בוצעה מתחת למכסה המנוע סטרילי באמצעות מכשירים לנקות עם 70% 2 propanol. עובי פורסים מוגדר 2000 מיקרון וחותכים בעזרת סכין הדדיות בסל"ד 22-26.
- רקמות נשטף בתמיסה אנטיביוטיקה שלוש פעמים.
- רקמות מצורף שלב הרכבה באמצעות דבק רעיל (Dermabond).
- עובי פורסים מוגדר חיתוך מושגת בסל"ד 22-26.
- Slices נשמרות בינוני תרבות 6-היטב מנות התרבות (פרוסה אחת לכל היטב) בשעה 37 ° C עם 5% CO 2 בסביבה humidified.
ג. ג'ין למסירה פרוסות הרקמה
- Slices הם מראש מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפני הטיפול.
- בינוני תרבות מוחלף מדיום טיפול.
- Slices מוזרקים ישירות עם וקטור ויראלי (25 μl של חלקיקים נגיפיים Ad5.CMVluc [1x10 9]). לחלופין, חלקיקים ניתן להוסיף המדיום, עבור עירוי פסיבי.
- אחרי שעתיים של דגירה, סרום נוסף בינוני.
IV. ניתוח של ביטוי גנים על ידי ניתוח bioluminescent
- Slices מוזרקים עם 100 μl של המצע luciferin (3 מ"ג / מ"ל).
- 6 גם צלחת תרבות מושם על הבמה מודגרות עבור 10 דקות.
- הם צילמו פרוסות דקות 5 ברגישות גבוהה (איור 1).
V. תוצאות נציג
באיור 1. הדמיה Bioluminescent של פרוסות הכבד החולה באמצעות מערכת זיהוי IVIS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים vivo לשעבר החולה רקמות תרבות שיטה ומערכת זיהוי bioluminescent להערכת משלוח הגן בתוך הרקמה הלא קבוע האנושי. השיטה מציעה דרך פשוטה לשחזור של פרוסות הרקמה culturing. יש לו פוטנציאל משמעותי שכן היא מאפשרת את לימוד משלוח הגן לתוך רקמה אנושית שלם, ניתוח ואספקה הגן לתוך מגוון של רקמה אנושית כולל רקמות ממאירות והוא יכול לספק מידע חשוב לגבי ההשפעות של מידה רבה של השתנות בין חולים בודדים עם כבוד כדי ספיגת גן. סוגי סרטן שונים ייתכן משתנה משפיע על היעילות של השלבים השונים של הביטוי transgene מוצלח בתאים, מעורבים ספיגת שעתוק דנ"א תרגום עתידיים. צעדים אלה המפורטות אנימציה וידאו, באמצעות וקטור ויראלי כדוגמה. מערכת זיהוי bioluminescent מדגים כימות מהיר ומדויק של ביטוי גנים בתוך פרוסות בודדות ללא צורך להקריב רקמות. עבור וקטורים שכפול פסול, כמו מועסקים במחקר זה, הארה קשורה ישירות ביטוי גנים על ידי התאים.
זו מערכת מודל יספק מידע רב ערך לגבי משלוח גן לרקמה החולה לקראת ניסוי קליני להיכנס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה דרך קורק בדרום מרפאת קופת ויקטוריה אוניברסיטת השד בבית החולים, האגודה למלחמה בסרטן אירי (CRI07TAN) לבין סרטן קורק מרכז המחקר. פסול שכפול רקומביננטי adenovirus 5 חלקיקים בשליטת תעתיק של האמרגן CMV הייתה מתנה סוג של פרופ 'אנדרו בייקר, מאוניברסיטת גלזגו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
- Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
- Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
- Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).
