Summary
Este artigo descreve a cultura de fatias de tecido de pacientes para estudos de genes de entrega e análise de expressão gênica utilizando IVIS imagem de bioluminescência.
Abstract
Este vídeo descreve o uso de tecido do paciente como um modelo ex vivo para o estudo da entrega do gene. Tecido do paciente fresca obtida no momento da cirurgia é cortado e mantidas em cultura. O sistema modelo ex vivo permite a entrega física de genes em tecidos de pacientes intactos e expressão do gene é analisado por imagem de bioluminescência usando o sistema de detecção de IVIS. O sistema de detecção bioluminescentes demonstra quantificação rápida e precisa da expressão do gene dentro fatias individuais sem a necessidade de sacrificar tecido. Esta fatia do sistema de cultura de tecidos pode ser utilizado em uma variedade de tipos de tecidos, incluindo o tecido normal e maligno e nos permite estudar os efeitos da heterogeneidade do tecido intacto e do alto grau de variabilidade entre pacientes individuais. Este modelo de sistema poderia ser usado em determinadas situações como uma alternativa aos modelos animais e como um modo de pré-clínicos complementares antes de entrar em teste clínico.
Protocol
Preparação de Mídia e Reagentes
- Solução de antibióticos
Tampão fosfato salino (PBS) com 200 U / ml de penicilina, estreptomicina 200 mg / ml, 5 mg / ml Fungizone - Média de coleta e tratamento
Dulbecco modificado da águia (DMEM) com 200 U / ml de penicilina, estreptomicina 200 mg / ml, 5 mg / ml Fungizone - Meio de cultura
Médio coleção contendo 10% inativado pelo calor soro fetal bovino
I. coleção de tecidos e de armazenamento
Aprovação para a coleta do tecido do paciente foi obtida a partir da Clínica de Ética em Pesquisa dos Hospitais de Ensino Cork e consentimento informado foi obtido dos pacientes na véspera da cirurgia. Tecido hepático foi obtido de pacientes submetidos a hepatectomia parcial de doença maligna.
- Tecido fresco paciente é obtido no momento da ressecção cirúrgica.
- Tecido é armazenado nos meios de comunicação coleta a 4 ° C (tecido podem ser armazenadas sob refrigeração por até 12 h sem perda significativa de viabilidade, no entanto processamento imediato é recomendado).
II. Preparação do tecido fatia e cultura
Corte foi realizado utilizando um vibratome (Leica, Alemanha). O sistema de corte de tecido foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Preparação fatia de tecido foi realizada sob um capuz estéreis, utilizando instrumentos limpos com 70% 2-propanol. Espessura de corte é de 2.000 microns e cortados com uma lâmina alternativo em 22-26 rpm.
- Tecido é lavado em solução antibiótica três vezes.
- Tecido está ligado à fase de montagem usando non-toxic adesiva (Dermabond).
- Espessura de corte é definida e corte é realizado a 22-26 rpm.
- Fatias são mantidas em meio de cultura em placas de 6 poços de cultura (uma fatia por poço) a 37 ° C com 5% de CO 2 em um ambiente umidificado.
III. A entrega do gene em fatias de tecido
- Fatias são pré-incubadas a 37 ° C por 2 h antes do tratamento.
- Meio de cultura é substituído por meio de tratamento.
- Fatias são diretamente injetados com o vetor (25 mL de partículas virais Ad5.CMVluc [1x10 9]). Viral Alternativamente, as partículas podem ser adicionadas ao meio, para perfusão passiva.
- Após duas horas de incubação, o soro é adicionado ao meio.
IV. Análise de expressão gênica por análise bioluminescentes
- Fatias são injetados com 100 ul de substrato luciferina (3 mg / ml).
- 6-bem placa de cultura é colocada no palco e incubados por 10 min.
- Fatias são gravadas por 5 min a alta sensibilidade (Figura 1).
Representante Resultados V.
Figura 1. Bioluminescent imagem de fatias de fígado de pacientes, utilizando IVIS sistema de detecção.
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Discussion
Nós descrevemos um paciente vivo ex método de cultura de tecidos e sistema de detecção de bioluminescentes para a avaliação de entrega de genes no interior não fixa o tecido humano. O método oferece uma maneira simples e reprodutível de fatias de tecido de cultura. Ele tem um potencial significativo, pois permite o estudo da entrega do gene no tecido humano intacto, a análise da prestação de gene em uma variedade de tecidos humanos, incluindo tecido maligno e pode fornecer informações importantes sobre os efeitos do elevado grau de variabilidade entre pacientes individuais com respeito para captação de gene. Tipos diferentes de câncer podem ter variadas influências sobre a eficácia das diferentes fases de expressão do transgene em células de sucesso, envolvendo captação de DNA e posterior transcrição e tradução. Essas etapas são descritas na animação de vídeo, usando vetor viral como um exemplo. O sistema de detecção bioluminescentes demonstra quantificação rápida e precisa da expressão do gene dentro fatias individuais sem a necessidade de sacrificar tecido. Para vetores de replicação incompetente, como empregado neste estudo, a luminescência está diretamente relacionada à expressão de genes por células.
Este modelo de sistema irá fornecer informações valiosas sobre a entrega do gene ao tecido do paciente antes de entrar em teste clínico.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado através da Enfermaria Cork South Victoria University Hospital fundo do peito, a Sociedade do Câncer irlandês (CRI07TAN) e do Centro de Cork Cancer Research. Replicação incompetentes recombinante Adenovírus 5 partículas sob o controle transcricional do promotor CMV foi um presente amável do Prof Andrew Baker, da Universidade de Glasgow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
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