Summary
Dieser Artikel beschreibt die Kultur der Patientensicherheit Gewebeschnitten für den Gentransfer-Studien und die anschließende Analyse der Genexpression mittels IVIS Biolumineszenz-Bildgebung.
Abstract
Dieses Video beschreibt die Verwendung von Gewebe des Patienten als ex vivo-Modell für die Untersuchung der Gene Delivery. Frisches Gewebe des Patienten zum Zeitpunkt der Operation gewonnen wird in Scheiben geschnitten und in Kultur gehalten. Die ex vivo-Modell-System ermöglicht die physische Lieferung von Genen in intakte Gewebe des Patienten und die Genexpression durch Biolumineszenz-Bildgebung mit dem IVIS Detection System analysiert. Die Biolumineszenz Detection System zeigt eine schnelle und genaue Quantifizierung der Genexpression in einzelne Segmente, ohne dass Gewebe zu opfern. Diese Scheibe Gewebekultur-System kann in einer Vielzahl von Gewebetypen einschließlich der normalen und malignen Gewebe verwendet werden und ermöglicht es uns, die Auswirkungen der heterogenen Natur der intakten Gewebes und der hohe Grad an Variabilität zwischen den einzelnen Patienten zu untersuchen. Dieses Modell System könnte in bestimmten Situationen als Alternative zu Tierversuchen und als ergänzende präklinische Modus vor dem Eintritt in klinische Studie verwendet werden.
Protocol
Vorbereitung der Medien und Reagenzien
- Antibiotika-Lösung
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 200 U / ml Penicillin, 200 ug / ml Streptomycin, 5 ug / ml Fungizone - Sammlung und Behandlung Medium
Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 200 U / ml Penicillin, 200 ug / ml Streptomycin, 5 ug / ml Fungizone - Nährboden
Sammlung Medium mit 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Rinderserum
I. Tissue Datenerhebung und-speicherung
Zulassung für Patienten Gewebe Sammlung wurde von der Clinical Research Ethics Committee der Cork Teaching Hospitals erhalten und Einwilligung wurde von den Patienten am Tag vor der Operation erhalten. Lebergewebe wurde von Patienten, bei denen eine partielle Hepatektomie für bösartige Erkrankung erhalten.
- Frisches Gewebe des Patienten zum Zeitpunkt der chirurgischen Resektion erhalten.
- Das Gewebe wird in der Sammlung Medien Lagerung bei 4 ° C (Tissue gespeichert werden können gekühlt bis zu 12 h ohne nennenswerten Verlust der Lebensfähigkeit, aber sofortige Verarbeitung wird empfohlen).
II. Gewebeschnitt Vorbereitung und Kultur
Slicing wurde mit einem Vibratom (Leica, Deutschland). Das Gewebe schneiden System wurde nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Gewebeschnitt Präparat wurde unter einer sterilen Haube mit Instrumenten mit 70% 2-Propanol gereinigt durchgeführt. Schichtdicke ist bei 2000 Mikrometer eingestellt und schneiden mit einer Hin-Klinge bei 22-26 Umdrehungen pro Minute.
- Das Gewebe wird in Antibiotika-Lösung dreimal gewaschen.
- Das Gewebe wird zur Montage der Bühne mit ungiftigen Kleber (Dermabond) befestigt.
- Schichtdicke eingestellt ist und das Schneiden ist bei 22-26 Umdrehungen pro Minute erreicht.
- Scheiben sind in Kulturmedium in 6-well Kulturschalen (eine Scheibe pro Well) bei 37 ° C mit 5% CO 2 in eine feuchte Umgebung.
III. Gene Lieferung an Gewebeschnitten
- Scheiben werden bei 37 vorinkubiert ° C für 2 h vor der Behandlung.
- Kulturmedium wird mit der Behandlung Medium ersetzt.
- Slices sind direkt mit viralen Vektor (25 ul von Viruspartikeln Ad5.CMVluc [1x10 9]). Injiziert Alternativ können Partikel, die zugesetzt werden, für passive Infusion.
- Nach zwei Stunden Inkubation wird Serum zugesetzt.
IV. Die Analyse der Genexpression durch Biolumineszenz-Analyse
- Scheiben sind mit 100 ul Luciferin-Substrat (3 mg / ml) injiziert.
- 6-well Kulturschale auf der Bühne platziert und für 10 min inkubiert.
- Scheiben sind für 5 min bei hoher Empfindlichkeit (Abbildung 1) abgebildet.
V. repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Bioluminescent Bildgebung von Patienten mit Leber-Scheiben IVIS Detection System.
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Discussion
Wir beschreiben eine ex vivo Patienten Gewebekultur-Methode und Biolumineszenz Detection System für die Beurteilung der Gen-Lieferung innerhalb von nicht fixierten menschlichen Gewebe. Das Verfahren bietet eine einfache und reproduzierbare Weise der Kultivierung Gewebeschnitten. Es hat ein erhebliches Potenzial, wie es das Studium der Gentransfer in intakte menschliche Gewebe, die Analyse der Gene Delivery ermöglicht in einer Vielzahl von menschlichem Gewebe einschließlich bösartiger Gewebe und können wichtige Informationen über die Auswirkungen der hohen Variabilität zwischen den einzelnen Patienten in Bezug bieten Gen-Aufnahme. Verschiedene Krebsarten haben unterschiedliche Einflüsse auf die Wirksamkeit der verschiedenen Stadien der erfolgreiche Transgenexpression in den Zellen, an denen DNA-Aufnahme und die anschließende Transkription und Translation. Diese Schritte sind in der Video-Animation dargestellt, mit Hilfe viraler Vektor als ein Beispiel. Die Biolumineszenz Detection System zeigt eine schnelle und genaue Quantifizierung der Genexpression in einzelne Segmente, ohne dass Gewebe zu opfern. Für die Replikation inkompetent Vektoren, wie in dieser Studie verwendet wird, ist Lumineszenz in direktem Zusammenhang mit der Genexpression von Zellen.
Dieses Modell System bietet wertvolle Informationen über Gen-Lieferung an Gewebe des Patienten vor dem Eintritt in klinische Studie.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Cork South Infirmary Victoria University Hospital Breast Fonds, die Irish Cancer Society (CRI07TAN) und Cork Krebsforschungszentrum finanziert. Replication inkompetent rekombinanten Adenovirus 5 Partikel unter der transkriptionellen Kontrolle des CMV-Promotors war eine Art Geschenk von Prof. Andrew Baker, University of Glasgow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
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