Summary
Hier beschrijven we een methode voor een efficiënte cryopreservatie en ontdooiing van de corticale hersenweefsel blokken om hoogverrijkt neuronale culturen te genereren. Deze eenvoudige protocol biedt flexibiliteit voor latere generatie van de neuronale, astrocyten, en neuronale voorloper celculturen.
Abstract
In deze studie, schetsen we een gestandaardiseerd protocol voor de succesvolle cryopreservatie en het ontdooien van corticale hersenweefsel blokken om hoogverrijkt neuronale culturen te genereren. Voor dit protocol het gebruikte medium bevriezing is 10% dimethylsulfoxide (DMSO) verdund in gebufferde zoutoplossing Hank's (HBSS). Blokken van corticale weefsel zijn overgebracht naar cryovials met de bevriezing medium en langzaam ingevroren bij -1 ° C / min in een tempo-gecontroleerde bevriezing container. Post-dooi verwerking en scheiding van bevroren weefsel blokken consequent geproduceerd neuronale verrijkte culturen die een snelle groei neuritische tentoongesteld tijdens de eerste 5 dagen in cultuur en aanzienlijke uitbreiding van het neuronale netwerk binnen 10 dagen. Immunocytochemische kleuring met de astrocytaire marker gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en de neuronale marker beta-tubuline klasse III, toonde grote aantallen neuronen en astrocyten in de culturen. Generatie van neurale voorloper van celculturen na weefsel blok dissociatie resulteerde in snel groeiende neurospheres, waar een groot aantal neuronen en astrocyten geproduceerd onder condities differentiëren. Dit eenvoudige cryopreservatie protocol maakt het mogelijk om een snelle, efficiënte en goedkope behoud van corticale hersenweefsel blokken, die meer flexibiliteit voor de latere generatie van de neuronale, astrocyten, en neuronale voorloper van celculturen subsidies.
Protocol
1. Cryopreservatie van corticale Tissue Blokken
Materiaal Voorbereiding
- Bereid Buffered Salt 1X Hank's Solution (HBSS), door het verdunnen van 10x stockoplossing in steriel water (1:9). Bewaar HBSS bij 4 oC.
- Bereid 10% DMSO bevriezen medium door verdunning van DMSO in HBSS (1:9). De bevriezing medium moet worden vers gemaakt voor cryopreservatie en opgeslagen bij 4 oC tot gekoeld.
- Een stalen scheermesje wordt gebruikt voor de systematische hakken van weefsel. Voor gebruik, is het scheermes gesteriliseerd door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 2 uur. Onmiddellijk voor de verwerking van weefsel, spoel het scheermes met steriel water 3 keer. Laat het scheermes in steriel water voor een buitensporige hoeveelheid tijd, want het is gevoelig voor oxidatie.
- Een Nalgene bevriezing container is geladen met cryovials (2,5 ml) en daarna bracht in een steriele biologische kast. 1 ml van gekoeld bevriezing medium wordt toegevoegd aan elke flacon. De bevriezing container wordt vervolgens geplaatst op 4 oC gedurende ten minste 2 uur.
Reiniging, Hakken, en Freezing
- Het hersenweefsel te bevriezen is gereinigd van meningeale membraan en bloedvaten. Gebruik steriele naald tips om voorzichtig vuil te verwijderen uit het weefsel tijdens het werken op de top van een ijslaag. Schoongemaakt weefsel moet licht worden gespoeld met koud HBSS en overgebracht naar een nieuwe petrischaal voor het hakken.
- Werken op de top van een ice-pack, gebruik dan een gesteriliseerd scheermes om het weefsel snel in stukken hakken van ongeveer 1 mm 3 blokken. Werken met kleine porties van gereinigde weefsel in een tijd resulteert in een betere controle over de hakken procedure, wat resulteert in meer uniforme afmetingen van de blokken.
- Voeg langzaam gehakt weefsel in 50 ml HBSS in een 50 ml conische buis. Voorzichtig spoelen van de petrischaal met HBSS in om resterende weefsel blokken te verzamelen. Laat het weefsel blokken af te dalen naar de bodem van de buis, het creëren van een losjes weefsel te blokkeren pellet.
- Terwijl het weefsel is bezinking, brengen de eerder gekoelde container en bevriezing cryovials in de biologische veiligheid kabinet. Haal het beschermkapje alle cryovials om het proces van het toevoegen van weefsel te bespoedigen.
- Na al het weefsel blokken hebben gevestigd, Zuig voorzichtig het overtollige HBSS, waardoor een zeer dunne laag van de media boven de pellet. Centrifugeren wordt afgeraden omdat het zal leiden tot het weefsel blokken om aan elkaar te hechten, aanzienlijk verminderen bevriezing efficiency.
- Langzaam verzamelen 200 pi van de bodem van de losse weefsel blok pellet door gebruik te maken pipetpunt met brede openingen (cut tip met een steriele schaar). Overdracht van het materiaal een cryovial en ga naar de volgende, weer het verzamelen van weefsel uit de bodem van de pellet. Het is essentieel dat de gehele weefsel toewijzingsprocedure niet meer dan 3-4 min. per bevriezing container. Dit zorgt ervoor dat het weefsel wordt blootgesteld aan DMSO voor slechts een korte periode van tijd is voordat het vriespunt. Na de overdracht van het weefsel om de flesjes, plaatst u de container in een bevriezing-80 ° C vriezer voor minstens 4 uur. Als alternatief kan de bevriezing container 's nachts worden achtergelaten bij -80 oC. Herhaal deze procedure voor de resterende bevriezing containers.
- Breng de cryovials van de bevriezing container (s) om een cryobox en plaats het in een vloeibare stikstof tank voor opslag op lange termijn.
2. Ontdooien en kweken van Frozen Cortical Tissue Blokken
Materiaal Voorbereiding
- Een dag voorafgaand aan het ontdooien weefselmonsters, poly-L-lysine gecoat Petrischaaltjes / dekglaasjes worden voorbereid. In het algemeen, voor de corticale neuronen bereiden wij gecoat gerechten met 500 ug / ml of 1 mg / ml. Voeg genoeg poly-L-lysine-oplossing (made in boraatbuffer) om volledig te dekken van de bodem van de schaal. Als glas dekglaasjes nodig is, ervoor te zorgen dat ze volledig worden ondergedompeld in de poly-L-lysine oplossing. Incubeer gedurende minstens 12 uur. Voor het gebruik, grondig afspoelen van de gerechten met een flinke hoeveelheid steriel water 3 keer, 5 min per stuk.
- Warm HBSS wordt gebruikt om weefsel ontdooid en aan het weefsel dissociëren in cel suspensies schoon te maken. Het volume van de benodigde HBSS zal variëren afhankelijk van de hoeveelheid weefsel te worden ontdooid, maar typisch een cryovial zal verdunnen in 50 ml HBSS en uiteen zal in 10 ml HBSS.
- Dulbecco's Modified Eagle Medium met 10% ijzer-aangevuld met bovine kalf serum (EBS) en 1% antibiotica / antimycotica (AA) mengsel (DMEM (++)) moeten worden geplaatst in een 37 ° C waterbad.
- Plating medium (NB (+++)) moet worden vers gemaakt voor gebruik. Dit medium wordt bereid door toevoeging van 1% antibiotica / antimycotica plus B27 en N2 supplementen.
Let op: Media namen toegevoegd met kruisjes (+) geven de toevoeging van additieven aan de basis samenstelling van de media. In deze tekst, DMEM (+ +) geeft aan DMEM plus 10% EBS plus 1% AA, terwijl NB (+++) duidt NB plons 1% AA plus B27 plus N2.
Ontdooien en kweken
- Haal de cryovials uit de vloeibare stikstof tank en snel ontdooien bij 37 ° C in een waterbad tot slechts een klein ijs pellet wordt waargenomen in de flacon inhoud.
- Voorzichtig overdracht van de inhoud van de injectieflacon tot 50 ml van de warme HBSS in een conische buis. Gebruik een brede opening tip om voorzichtig los te maken de resterende weefsel blokken vastzitten in de cryovial. Keer de buis 3-4 keer en laat het weefsel langzaam te verzamelen op de bodem. Weefsel moet snel te regelen, maar als de blokken zijn te klein dit kan niet gebeuren en licht centrifugeren (~ 200 x g) wordt aanbevolen.
- Aspiratie overtollige HBSS.
- Voeg 10 ml warm HBSS aan het weefsel pellet en 300 pi van 0,25% trypsine en 50 pi van DNAase. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 5 min, en breng vervolgens in een rondschudapparaat ingesteld op 80 toeren per minuut en 37 ° C voor een extra vijf minuten.
- Na deze periode, breng het weefsel blokken in een biologische veiligheid kast en gebruik een 10 ml pipet zorgvuldig te ageren het weefsel blokken tot een troebel celsuspensie wordt gevormd. Deactiveer de trypsine door het toevoegen van 10 ml warm DMEM (+ +) aan de celsuspensie.
- Centrifugeer de gedissocieerde cellen bij 1200 x g gedurende 5 minuten. Zuig Verwijder de bovenstaande vloeistof, resuspendeer de cel pellet in 10 ml warm DMEM (+ +) en kwantificeren van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
- Plaat cellen op poly-L-lysine gecoat gerechten. Meestal zal een 60-mm schaal worden bedekt met een 1x10 6 cellen.
- Laat de cellen te hechten aan de schotel / dekglaasjes voor ongeveer 1 uur in de weefselkweek incubator. Het wordt aanbevolen om de voortgang van de hechting te controleren in een plaat elke 10 min tot effectieve beslag wordt waargenomen. Dan, voorzichtig vervangen door het medium met vers DMEM (++).
- Na 24 uur, vervang dan de DMEM (+ +) met warm NB (+++). Gedeeltelijke medium veranderingen (50%) worden uitgevoerd om de 5 dagen met verse NB (+++). Gezonde culturen meestal vertonen tekenen van differentiatie en de groei van de processen na 24 uur. Onder deze omstandigheden, en het uitvoeren van een gedeeltelijke medium verandert elke 4-5 dagen, kan de culturen worden gehandhaafd voor langere tijd tot 4-6 weken.
- Voor het genereren van neuronale voorloper cellen (NPC's), is een vergelijkbaar protocol gebruikt met de uitzondering dat na het centrifugeren, DMEM zonder EBS wordt gebruikt. Cellen worden uitgeplaat in T-25 flessen in DMEM/F12 (1:3), aangevuld met B27 en EGF (20 ng / ml) tot de vorming van neuropheres mogelijk te maken. Om onderscheid te NPC's, zijn neurospheres uitgeplaat op laminine (10 ug / ml) beklede dekglaasjes in DMEM/F12 (1:3) medium aangevuld met N2.
3. Representatieve resultaten
Gezonde culturen zal een aanzienlijke groei en de differentiatie na 5 dagen na het ontdooien en zal meestal in de groei te stabiliseren door 10 dagen (Figuur 1). Immuncocytochemical kleuring van deze culturen onthult tal van astrocyten (Figuur 2A) en neuronen (figuur 2B) voor zowel mens als de rat primaire neuronale culturen. Dit protocol is ook geschikt voor het genereren van NPC's als vrij zwevende neurospheres (figuur 3A), die onder differentiëren omstandigheden, resulteren in een hoge kwaliteit gemengde culturen (Figuur 3B, C).
Figuur 1. Celculturen van bevroren menselijke corticale weefsel. Frozen menselijk weefsel corticale blokken zijn ontdooid en uitgeplaat op poly-lysine beklede dekglaasjes en geteeld voor 10 dagen. Op dag 5 celexpansie blijkt en door de dag 10 confluentie bereikt. Schaal bar: 100 urn.
Figuur 2. Immunocytochemische kleuring van celculturen. (A) Kweken werden gekleurd met de gliale marker gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP, dikke pijlen). (B) Neuronen werden gedetecteerd met de neuronale marker beta-tubuline III (TIII, dunne pijlen). (C) Zowel de mens als de rat culturen tonen overvloedige glia en neuronen na 10 dagen in de cultuur. Primaire antilichamen: muis anti-GFAP (1:1000) en konijn anti-TIII (1:1000). Secundaire antilichamen: anti-muis Alexa 594 (1:500) en anti-konijn Alexa 488 (1:500). Kernen vlekken: Hoestch blauw (1:1000). Schaal bar: 50 pm.
Figuur 3. Genereren van neurospheres. (A) Bevroren weefsel werd verwerkt zoals hierboven beschreven en mag zich nu voortplanten als neurospheres. (B) Neurospheres werden uitgeplaat op glas dekglaasjes onder differentiëren voorwaarden en gegroeid gedurende 10 dagen, wat resulteert in de cellen migreren weg van de neurosphere. (C) Zowel de neuronen en astrocyten aanwezig zijn in de groeiende rand van een onderscheidende neurosphere. Nucleaire tegenkleuring, primaire en secundaire antilichamen gebruikt als in figuur 2.
Discussion
Cryopreservatie biedt een mogelijkheid om de bank kostbare hersenweefsel monsters voor toekomstig gebruik. Hier beschrijven we een eenvoudige maar effectieve protocol om zowel neuron verrijkt culturen en neuronale voorloper cellen van ingevroren hersenweefsel blokken te genereren. Deze economische procedure vermijdt de kosten van traditionele cryopreservatie technieken die duurdere tarief-gecontroleerde vriezers gebruiken. Het protocol zorgt voor de generatie van levensvatbare neuronale culturen post-ontdooien door middel van een snelle maar effectieve manier om weefsel blokken bevriezen. Het gehele proces kan invriezen zo weinig als 20 minuten. Naast de primaire neuronale culturen, kan het gebruik van deze methode weefsel blokkeert ook worden ontdooid om NPC's gegroeid als vrij zwevende neurospheres te genereren. In dit verband het gebrek aan serum in onze bevriezen medium zorgt ervoor dat cellen worden bewaard in een ongedifferentieerde staat. Onder onderscheidende omstandigheden, neurospheres uit bevroren weefsel tonen uitbreiding en differentiatie tarieven zeer vergelijkbaar met neurospheres gegenereerd op basis van verse weefsel.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Undergraduate Research Opportunities Program aan de UCI (AR en SP) en subsidies van de staat van de ziekte van Alzheimer Californië Initiative en de National Institutes of Health te verlenen niet. HD38466, en de ziekte van Alzheimer Research Center geen subsidie. AG16573 (JB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X |
| Bovine calf serum supplemented | Hyclone | SH30072.03 | For culture medium |
| Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium |
| Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation |
| Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | Tissue dissociation |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium |
| Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells |
| antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination |
| Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells |
| Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| 21 G1 precision guide needles | BD Biosciences | 305165 | To clean tissue |
| 10 ml pipette | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | Individually wrapped |
| 50 ml tubes | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| Single edge razor blade | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | To chop tissue |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | For general culture |
| 100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | For cleaning tissue |
| Cryogenic box | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 2.0 ml cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | For freezing medium |
| Ethanol 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | For sterilizing razor blade |
References
- Robbins, R. J. Cryopreservation of human brain tissue. Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
