Summary
此协议是一个成本效益的替代方案，为高效的并行澄清和质粒DNA纯化
Abstract
我们描述AcroPrep提前96个质粒的准备滤板的完整的过程，从原核文化，并以高纯度的DNA结尾。基于多井过滤细菌裂解液检查和DNA纯化，这种方法创建一个质粒编制的精简过程。含有硅为基础的媒体的过滤板可以很容易地处理，真空过滤或离心产生可观数量的质粒DNA。定量分析确定纯化的质粒DNA是高品质的一贯平均OD 260/280比值1.97 。总体而言，质粒产量提供更纯净的DNA测序和克隆，下游应用，如。这种简化方法采用AcroPrep提前滤板允许手动，半自动或全自动化处理。
Protocol
1。裂解液间隙
- 成长大肠杆菌改造所需的质粒DNA在深孔板（1毫升文化/）卢里亚肉汤与适当的抗生素一夜之间在37℃用颤抖的彗星的大肠杆菌培养。
- 佩莱大肠杆菌的培养板在5000 10分钟的XG，然后倒出上清液。
- 每100μL，再悬浮缓冲液（50毫米的Tris - HCl，pH值8.0，10 mM的EDTA，100微克/毫升RNA酶A）重悬沉淀。
- 加入100μL/孔裂解液（200毫米氢氧化钠，1％SDS）和摇板振动筛2分钟。
- 加入100μL/孔和缓冲液（3.0 M醋酸钾，pH值5.5），振摇2分钟。
- 转移细胞裂解液，裂解液澄清板。
- DNA结合的板350μL收集板和成真空歧管底部的地方上。组装真空歧管（见图1）。
- 裂解液放置澄清真空装置上板。
- 应用在10英寸汞柱（0.34巴）真空，滤液收集到的DNA结合板。不要使用大于12英寸汞柱真空。 （0.41 bar）的。
- 拆开真空歧管。将2毫升废物收集板装置的底部。
2。 DNA结合
- 移动的DNA结合板多方面的顶部（见图2）。
- 加入300μL/孔约束力的缓冲区（6 M盐酸胍）和吸管向上和向下混合。
- 应用真空〜5英寸汞柱（0.17巴）缓慢真空和丢弃滤液。 DNA是现在势必膜。
- 与400μL洗涤缓冲液（80％乙醇）/清洗。
- 应用真空，然后丢弃滤液。如果使用2毫升收集板或过滤直接浪费丢弃不必要的。
- 重复洗一次。
- 吸干底部过滤板吸水毛巾擦干。
- 应用真空一次5-10分钟，以确保去除残留的异丙醇。
- 吸干底部，以确保去除乙醇滴。
3。 DNA的洗脱
- 添加70μL/孔洗脱缓冲液（10毫米的Tris - HCl，pH值8.0，1毫米EDTA）。如果需要较高的DNA浓度，体积可减少到50μL/孔，但平均总收益率将降低。
- 一分钟，在室温下孵育板。
- 可无论是真空或离心洗脱纯化的DNA。
- 真空法：将清洁的收集板（脱氧核糖核酸酶，核糖核酸酶自由）进入真空系统。放在真空歧管上的过滤板，适用于15英寸汞柱（0.5巴）1分钟真空，直到所有的洗脱缓冲液通过DNA结合板通过。收集纯化后的DNA（见图3）。
- 离心法：将清洁收集板的顶部和1000 XG 5分钟离心净化过滤板。
4。定量和定性分析
- 测量外径260/280，计算纯化的DNA的浓度。
- 进行了纯化的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析。
5。代表性的成果
大肠杆菌裂解液澄清使用传统的离心和帕尔AcroPrep提前裂解液澄清过滤板显示的碎片明显减少，从起始原料。 （图4）。
到TE缓冲液中加入三个浓度的质粒DNA，并通过AcroPrep提前裂解液澄清过滤板通过。质粒DNA浓度的比较，前，后过滤，显示在所有三个浓度〜100％的恢复（图5）。
为了证明澄清大肠杆菌的DNA恢复添加到原油裂解大肠杆菌裂解，质粒DNA，然后通过过滤澄清。相同的质粒DNA加入到细胞裂解液以下过滤。电泳是从每个样本（图6）等分。一个单一的，从每个样品类似强度的明确乐队演示一点在澄清过滤步骤如有DNA损失。
文化的E.从 E 大肠杆菌含有PCAT质粒DNA纯化大肠杆菌裂解液使用颇尔公司的350μL和1毫升的DNA结合过滤板，以及两个其他品牌的350μL的DNA结合板。所有纯化制造商建议的协议规定执行。颇尔公司的1毫升AcroPrep进展DNA纯化过滤板（图7和表2）从最高的DNA浓度和总收率。
虽然竞争对手W也显示了DNA浓度高（155毫微克/μL），总DNA的产量是最低的（4.7微克/孔），由于回收量低，〜30微升。竞争者中号了108纳克/μL总产的5.6微克/以及DNA的最低浓度。
洋菜OSE凝胶纯化从三种不同的DNA结合板PCAT DNA分析，如图8所示。每次采集的样本量调整至65μL，以正确的回收量的差异，以电泳前。所有样品超螺旋质粒DNA，但每个滤板的DNA收益率各不相同。
图9显示了所有准备的DNA超螺旋的形式，也有类似的的浓度。
图1。大会歧管的真空裂解液澄清 。
图2。大会的DNA结合真空歧管 。
图3。大会真空歧管真空洗脱。
图4。过滤简化了样品澄清。一式三份样品300μL真空过滤（350微升AcroPrep提前裂解液澄清过滤板）或传统的离心澄清原油裂解。外径320测量之前和之后的澄清。
图5。 PDNA通过后，通过AcroPrep提前裂解液澄清过滤板的全面恢复。 300μLTE缓冲液中添加与PCAT在25，50和100微克/毫升。 DNA浓度和恢复计算外径260过滤前后，N = 2。
图6。 PCAT的DNA后的恢复澄清 。裂解液之前或之后澄清飙升的pUC19相等，则稀释1至10日在TE缓冲液。装2微升/ 1.2％琼脂糖凝胶上的车道。
图7。质粒DNA，每口井产量与PALL Acroprep进展DNA结合比竞争对手板过滤板 。PCAT质粒DNA产量（ 外径 260）使用1毫升（帕尔和竞争对手中号）或1.5毫升（竞争对手宽）过夜培养的指示的DNA纯化板DH5α中。净化用板制造商的推荐协议。误差线表示标准错误（N> 6）。
图8。琼脂糖凝胶电泳分析PCAT的DNA纯化表示DNA结合板 。 1.2％，纯化的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳。由三个独立的净化池的样品，洗脱液净化后，稀释1:10调整至65μL。装2％μL巷。
图9。纯DNA相似的离心或真空方法最终洗脱液收集纯化的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳时的质量和恢复。其次PDNA净化AcroPrep预先过滤板制造商的建议协议。洗脱在1000 XG离心5分钟或2分钟与15英寸汞柱（0.5巴）的真空。
Discussion
我们描述了一个浅显的，精简AcroPrep提前滤板的协议，给予几个优点。在手工，半自动化或全自动化AcroPrep提前格式的处理时，这种方法提供了最大的质粒DNA产量。对裂解间隙板的集成预过滤，提供样品，即使是那些含有较高水平的微粒过滤一致。更快，更均匀，整个板块的滤过率，以最小的滞留量板的结果以及几何;和出口尖几何提供了直接到接收板样品流，无交叉污染的关注。更重要的是，高的DNA结合能力AcroPrep预先过滤板具有约束力板膜是优化高质量的质粒DNA的最大恢复。
Disclosures
此视频文章的作者是谁生产仪器和试剂的视频和文字的特色，颇尔生命科学的员工。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AcroPrep Advance Filter plate | Pall Corporation | PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl) | 3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification |
| AcroPrep Advance Filter Plate | Pall Corporation | PN 8132 | for DNA Binding |
| Vacuum manifold | Pall Corporation | PN 5017 | |
| Vacuum pressure pump | Pall Corporation | PN 13157 |
