Упрощенная очистка плазмидной ДНК из Прокариотические культур

Summary

Этот протокол представляет собой экономичную альтернативу для эффективных параллельных разъяснения и плазмиды очистки ДНК из

Abstract

Мы опишем полный процесс AcroPrep Advance фильтра Плиты для 96 плазмиды препаратов, начиная от прокариотических культуры и заканчивая высокой чистоты ДНК. На основе нескольких хорошо фильтрации для бактериальной очистки лизата и очистки ДНК, этот метод создает упрощенный процесс с плазмидной ДНК. Фильтры чашек, содержащих кремний-СМИ может быть легко обработан вакуумной фильтрации или центрифуги для получения заметных количеств плазмидной ДНК. Количественный анализ определить очищенной ДНК плазмиды неизменно высокого качества со средним диаметром _260/280 отношение 1,97. В целом, плазмиды дает предлагают более чистой ДНК для последующих приложений, таких как секвенирование и клонирования. Этот обтекаемый метод использования AcroPrep Advance фильтра пластин позволяет для ручной, полуавтоматический или полностью автоматизированной обработки.

Protocol

1. Лизат оформление

1. Расти Е. кишечной культур трансформированных желаемого плазмидной ДНК в глубокий колодец пластин (1 мл культуры / лунку) в бульоне Лурия с соответствующими антибиотиками в течение ночи при 37 ° C при встряхивании.
2. Гранул кишечная палочка в культуре табличку на 5000 мкг в течение 10 минут, затем перелить супернатант.
3. Ресуспендируют каждая гранула в 100 мкл буфера ресуспендирования (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 100 мкг / мл РНКазы).
4. Добавить 100 мкл / лунку Лизис буфера (200 мМ NaOH, 1% SDS) и встряхните использовании планшетном шейкере в течение 2 минут.
5. Добавить 100 мкл / лунку Нейтрализация буфера (3,0 М ацетата калия, рН 5,5) и встряхивают в течение 2 минут.
6. Передача Клеточный лизат к лизат разъяснения пластины.
7. Место связывания ДНК пластины сверху 350 мкл пластины коллекцию и поместить в нижней части вакуумного многообразия. Сборка вакуумного многообразия (см. Рисунок 1).
8. Место лизат разъяснения пластину на верхней части вакуумного аппарата.
9. Применение вакуума при 10 дюймов Hg (0,34 бар) и сбор фильтрата в связывания ДНК пластины. Не используйте вакуум больше 12 дюймов рт. (0,41 бар).
10. Разберите вакуумного многообразия. Место 2 мл сбора отходов пластина в нижней части аппарата.

2. Связывание ДНК

1. Перемещение связывания ДНК пластины в начало многообразии (см. Рисунок 2).
2. Добавить 300 мкл / лунку буфера для связывания (6 М гуанидин-HCl) и пипетка вверх и вниз, чтобы смешаться.
3. Применение вакуума [~ 5 дюймов Hg (0,17 бар) для медленных вакуум] и отбросить фильтрата. ДНК теперь связан с мембраной.
4. Промыть 400 мкл / лунку промывочного буфера (80% этанола).
5. Применение вакуума, затем удалите фильтрата. Удалите ненужные, если используются 2 мл коллекции плита или фильтрации непосредственно в отходы.
6. Повторите мыть один раз.
7. Пятно нижней части фильтра пластина на впитывающее полотенце для просушки.
8. Применение вакуумных еще раз в течение 5-10 минут, чтобы обеспечить удаление следов спирта.
9. Пятно снизу обеспечить удаление этанола капель.

3. ДНК Элюирование

1. Добавить 70 мкл / лунку элюции буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). Если выше концентрации ДНК желательно, объем может быть уменьшен до 50 мкл / лунку, но в среднем общий выход будет ниже.
2. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одной минуты.
3. Очищенная ДНК может быть элюировали либо вакуумом или центрифугирования.
4. Вакуумный метод: Поместите чистую тарелку коллекции (ДНКазы, РНКазы бесплатно) в вакуум многообразия. Место фильтр пластину на верхней части вакуумного многообразия, применять вакууме при 15 дюймов Hg (0,5 бар) в течение 1 минуты, пока все элюции буфера прошла через связывания ДНК пластины. Сбор очищенную ДНК (см. рисунок 3).
5. Центрифугирование Метод: Положите Фильтр для очистки пластины сверху чистую тарелку сбора и центрифуге при 1000 мкг в течение 5 минут.

4. Количественный и качественный анализ

1. Мера OD _260/280, рассчитать концентрацию очищенной ДНК.
2. Выполните агарозном геле анализ очищенного плазмидной.

5. Представитель Результаты

Кишечная палочка лизат уточнены с использованием традиционных центрифугирования и Pall AcroPrep Advance лизат разъяснения фильтра пластины показали заметное сокращение мусора из исходного материала. (Рис. 4).

ДНК плазмиды в трех концентрациях шипами в ТЕ буфере и проходил через лизат AcroPrep Advance разъяснения фильтр пластины. Сравнение концентрации ДНК плазмиды, пре-и пост-фильтрации, показывает ~ 100% восстановления (рис. 5) на всех трех концентрациях.

Чтобы продемонстрировать восстановление ДНК из уточнил Е. кишечной лизат, плазмиды ДНК шипами в сырой лизат, а затем уточнить путем фильтрации. Же ДНК плазмиды был добавлен в ячейке фильтрации следующие лизат. Электрофорез проводили на аликвоты из каждого образца (рис. 6). Единый, ясный полосы одинаковой интенсивности из каждого образца демонстрирует практически никакой ДНК потерь при фильтрации основе разъяснения шаг.

Культуры E. кишечной содержащие рСаЬ плазмидной ДНК очищали от E. кишечной лизатов использованием 350 Полла мкл и 1 мл связывания ДНК фильтра плиты, а также два других марок 350 мкл связывания ДНК пластин. Все очищения были выполнены, как указано в протоколе рекомендуется производителем. Самая высокая концентрация ДНК и полный выход показаны с 1 Полла мл AcroPrep Advance ДНК Фильтр для очистки пластин (рис. 7 и таблицу 2).

Хотя конкурентов W также показывает высокую концентрацию ДНК (155 нг / мкл), суммарный выход ДНК является самым низким (4,7 мкг / лунку) в связи с низким объемом восстановления, ~ 30 мкл. Конкурент М представил самую низкую концентрацию ДНК в 108 нг / мкл с общим выходом 5,6 мкг / лунку.

АгарOSE гель анализ очищенного рСаЬ ДНК из трех различных связывания ДНК пластин показано на рисунке 8. Каждый собранный объем пробы доводили до 65 мкл для корректировки различий в восстановлении объема до электрофореза. Все образцы показывают суперспиральной плазмидной ДНК, но ДНК доходность от каждого из фильтровальных плит варьируется.

На рисунке 9 показан подготовленный ДНК все в суперспиральной форме и имеет такие же концентрации.

Рисунок 1. Ассамблея Вакуумный коллектор для лизат разъяснение.

Рисунок 2. Ассамблея Вакуумный коллектор для связывания ДНК.

Рисунок 3. Ассамблея Вакуумный коллектор для вакуумной элюции.

Рисунок 4. Фильтрация упрощает образец разъяснения. Triplicate образцы 300 мкл сырой лизат осветляли вакуумной фильтрации (350 мкл AcroPrep Advance лизат разъяснения фильтр пластины) или традиционным центрифугирования. OD ₃₂₀ измеряется до и после разъяснения.

Рисунок 5. Полное восстановление плазмидной после прохождения AcroPrep Advance лизат пластины фильтра разъяснения. 300 мкл буфера TE подсыпали рСаЬ в 25, 50 и 100 мкг / мл. Концентрация ДНК и восстановления рассчитывается OD ₂₆₀ до и после фильтрации, N = 2.

Рисунок 6. Восстановление рСаЬ ДНК после разъяснения. Равные количества pUC19 шипами в лизат до или после разъяснений, затем разбавляют 1 до 10 в буфере TE. Загружено 2 мкл / полосы на 1,2% агарозном геле.

Рисунок 7. Высшее плазмиды выход ДНК на лунку с покров Acroprep Advance связывания ДНК фильтр пластины, чем конкурент пластин. РСаЬ плазмиды выход ДНК (OD ₂₆₀₎ с использованием указанных пластин очистки ДНК с 1 мл (Pall и Конкурент М) или 1,5 мл (Конкурент Вт) в течение ночи культуры DH5α. Очистка с использованием рекомендованных протокол пластины производителя. Ошибка полоски показывают стандартную ошибку (я> 6).

Рисунок 8. Агарозном геле анализ ДНК рСаЬ очищали на указанные связывания ДНК пластины. 1,2% агарозном гель-электрофорез очищенного плазмидной. Собранные пробы из трех отдельных очищения, элюата доводили до 65 мкл после очистки, разбавленный 1:10. Загружено 2 мкл на одну полосу движения.

Рисунок 9. Качество и восстановление чистой ДНК подобное, когда центрифуга или вакуумные методы используются для окончательного элюата коллекции агарозном гель-электрофорез очищенного плазмидной. Рекомендуется протокол производителя AcroPrep Advance Пластины фильтра последовали для очистки плазмидной ДНК. Элюирование исполнении центрифуге при 1000 мкг в течение 5 минут или вакуум с 15 дюймов Hg (0,5 бар) в течение 2 минут.

Discussion

Мы описываем поверхностное, обтекаемый протокол пластин AcroPrep Advance фильтра, который предоставляет ряд преимуществ. Этот метод обеспечивает максимальную доходность плазмиды ДНК, когда обрабатывается в ручном, полуавтоматическом или полностью автоматизированных форматов AcroPrep Advance. Интегрированный фильтр предварительной очистки на лизат пластины клиренс обеспечивает постоянную фильтрацию образцы, даже те, с высоким содержанием твердых частиц. И геометрия пластины приводит к более быстрой, более равномерное скорости фильтрации через пластины с минимальным ограбления объем и геометрию выходе наконечник обеспечивает прямой поток образцов в приемнике пластиной без проблем перекрестного загрязнения. Важно отметить, что высокие обязательные мембраны потенциала связывания ДНК пластины AcroPrep Advance Пластины фильтра оптимизирована для максимального извлечения высококачественной плазмидной ДНК.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157