Summary
Nöronal büyüme konileri dikenli biter görselleştirmek ve F-aktin ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Cam lamelleri kültür nöronlar sonra, hücreler saponin içeren bir çözüm permeabilize. Sonra, rodamin-aktin içeren saponin tamponu ile kısa bir inkübasyon ücretsiz aktin dikenli uçları üzerine floresan aktin içermektedir.
Abstract
Büyüyen aksonlar hareketli ipuçları büyüme konileri denir. Büyüme konileri, gelişmekte olan dokularda büyüme konisi reseptörlerine bağlanır ve yerel dinamikleri ve büyüme koni hücre iskeletinin 3-6 organizasyonu düzenleyen ifade edilen moleküler rehberlik ipuçları ile etkileşim yoluyla aksonlar seyreden yol açmaktadır. Bu seyir sinyallerinin ana hedefi, büyüme konisi çevre ve aktin polimerizasyonu sürekli ve dinamik bir yeniden şekillenme 7 ile bu sürücüleri büyüme konisinin motilite doldurur aktin filament ağda . Pozitif ya da çekici rehberlik ipuçları uyarıcı aktin filament (F-aktin) cezbedici işaret kaynağı yakın büyüme konisi çevre bölgede polimerizasyonu dönüm büyüme konisi neden olur. Bu aktin polimerizasyonu sürücüler, önde gelen marjı ve cezbedici doğru aksonal uzama yerel büyüme konisi çıkıntı, yapışma.
Aktin filament polimerizasyon yeterli aktin monomer durumu ve ek monomer polimerizasyonu çekirdekleri veya aktin filament dikenli biter bağlıdır. Aktin monomeri civciv retina ve dorsal kök gangliyon (DRG) büyüme konileri bol miktarda mevcuttur. Sonuç olarak, F-aktin dikenli biter monomer eklenmesi için kullanılabilir hale polimerleşme hızla artmaktadır. Bu daha yakın bir cezbedici 8-10 büyüme koni bölgede faktörü (ADF / cofilin) depolymerizing F-aktin kesilmesinin protein aktin yerel aktivasyon ile civciv DRG ve retinal büyüme konileri oluşur . Bu artan ADF / cofilin aktivite, yeni F-aktin polimerizasyonu için dikenli biter oluşturmak için aktin filamentler koparır. Aşağıdaki yöntem bu mekanizma ortaya koymaktadır. F-aktin Toplam içerik floresan Phalloidin ile boyanarak görünür hale getirilir. F-aktin dikenli uçları diğer hareketli hücreler 11, 12, önceki çalışmalarda adapte aşağıdaki açıklanan prosedüre permeabilize büyüme konileri içinde rodamin-aktin kuruluş tarafından görüntülenmiştir. Rodamin-aktin, aktin monomeri dikenli biter eklenmesi için kritik konsantrasyon üstünde bir konsantrasyon eklendiğinde, rodamin-aktin ücretsiz dikenli uçları üzerine toplanır. Çekici ipucu gibi bir büyüme konisinin bir tarafa yerleştirilmiş bir mikropipet serbest bırakılması gibi bir degrade, sunulan ise, F-aktin dikenli uçları üzerine rodamin-aktin katılması doğru mikropipet 10 büyüme konisinin tarafında daha fazla olacaktır .
Büyüme konileri küçük ve narin hücre yapıları. Permeabilization, rodamin aktin dahil, fiksasyon ve floresan görselleştirme işlemleri titizlikle yapılmaktadır ve ters bir mikroskop sahnede yapılabilir. Bu göç eden nöronlar, diğer birincil doku hücrelerinin veya hücre hatları yerel aktin polimerizasyonu eğitim yöntemleri uygulanabilir.
Protocol
Rodamin aktin etiketleme için, nöron, ya da "video" yemekler içine yapıştırılmış lamelleri 35 mm plastik tabaklar altına yerleştirilen cam lamelleri kültür.
1. Lameller hazırlanması ya da "Video" Yemekleri
- Birçok nöron tipleri, in vitro yüzeylerde kötü yapıştırıcı. Bu prosedür için gerekli olan Cam lamelleri, yeterli nöron-substrat yapışma yeterince temizlenmeli ve hazır olmadıkça izin vermeyebilir. Banker ve Goslin tarafından düzenlenen kitap Kültürleme Sinir Hücreleri, asit, cam lamelleri yıkama ve temizlik için detaylı bir prosedür açıklanmıştır. Alternatif olarak, heyecanla substrat moleküllerine bağlanır lamelleri, nitroselüloz kaplama aşağıdaki adımları 1.7 ve 1.8 olarak açıklanmıştır.
- Cam lamelleri (örneğin 18 mm kare veya 24 mm daire) dH 2 O durulanır ve organik izlerini silmek için pişmiş kuru ısı mümkün olduğunca (≥ 225 ° C) ve uzun (birkaç gün en az üç ay veya daha uzun). bileşikler. 1.6 veya 1.3 'e devam video yemekler için adıma gidin.
- Yüksek çözünürlük videomicroscopy için ince bir açık cam yüzey oluşturmak için, uygun çaplı bir elektrik mantar matkap kullanarak (ya da benzeri bir aletle) 35 veya 50 mm plastik Petri veya doku kültürü yemekleri dipleri yuvarlak delikler delinir. Sondaj plastik çatlamasını önlemek için hafif bir baskı ile yavaş yavaş yapılır. Her iki tarafta da düzgün bir yüzey oluşturmak için açılan deliğin kenarları makas ile kazınır.
- Cam lamelleri, 1.1 veya 1.2 'de açıklandığı gibi doku kültürü kullanmak için temizlenir. Lameller, toksik olmayan silikon akvaryum çimento (18x18mm lamelleri, 12mm çap biti kullanılır) kullanarak, deliklerinin üzerine yapıştırılır. Çimento, 24 saat boyunca tedavi.
- (Steril koşullar aşağıdaki adımları kullanılarak yapılır) video yemekler steril dH 2 O 3 kez yıkanır ve kurumaya izin.
- Lameller nöron kültürü için substrat molekülleri ile kaplanmıştır. İlk olarak, lamel yüzey (18x18 lamel için 250 mcL) ile 100 mikrogram / mL PBS nemlendirilmiş bir 38 ° C inkübatör 4-8 saat (veya gece) poli-D-lisin bir çözüm kaplanmıştır. Lameller sonra steril dH 2 O ile poli-D-lizin bağlanmamış kaldırmak için 3 kez yıkanır ve kuru hava izin. Birçok nöron tipleri, kültür ortamında serum proteinlerine dahil edildikleri takdirde, poli-D-lizin yalnız ile kaplı lamelleri kültüre. Ancak, in vivo koşullarda daha alakalı sonuçlar doğal substrat molekülleri kullanılarak elde edilir. Laminin, fibronektin veya L1 CAM (1-20 mcg / ml PBS içinde) olarak bu moleküller Çözümleri, 4-8 saat veya gece için poli-D-lizin kaplı lamelleri doğrudan uygulanabilir ama bizim laboratuvarda rutin olabilir kat, hücre adezyon moleküllerinin protein substrat bağlama artırmak için uygulamadan önce nitroselüloz ince bir film tabakası ile hazırlanan lamelleri.
- % 1, 5 ml% 100 amil asetat 5 g nitroselüloz eriterek nitroselüloz çözüm olun. 10 mcL lamel bu çözümü uygulayın ve hafifçe üzerine yayıldı. Hava kuruması 10 dakika.
- 25 mcg / ml laminin veya 4 mg / ml PBS içinde L1 CAM ve nitroselüloz yüzeyine yayılmış bir çözüm 250 mcL uygulayın. Nemlendirilmiş bir 38 ° C inkübatör, aspirat substrat (veya gece) 4 saat inkübe ve kültür ortamı hemen eklemek Yüzey kuru değildir.
2. Nöronal Kültürler hazırlanması
- Embriyonik gün 7 civciv embriyosunda yumurtadan kaldırılır ve kültür ortamı içeren bir stereomikroskopta kullanarak, toraks ve karın iç organları kaldırmak için diseksiyon için% 10 serum ile 100 mm petri kaplarına yerleştirilir.
- Embriyolar daha sonra orta ile durulanır ve sıvı besiyerinde 60 mm çanak taşındı ve daha dorsal kök gangliyon (DRG) veya nöral retina dokuları eksplantlar kaldırmak ve hazırlamak için disseke edilir. Hollenbeck ve Bamburg tarafından düzenlenen Hücre Biyolog, Yöntem ve Uygulamalar: Hücre Biyolojisi, hacim 71, Nöronlar ayrıntılı bir diseksiyon açıklamasına Yöntemleri olabilir. DRG eksplantlar 1/2-whole ganglionlar ve retina eksplantlar sinir çapı 1 mm veya daha az.
- Eksplantlar gereksiz dokular temizlendikten sonra, bireysel eksplantlar kültür ortamı ile kültür yemekler zaten lamelleri, forseps saatçiler, taşınır. Diseksiyon mikroskobu altında, eksplant inkübatör taşıma sırasında hareket etmesini önlemek için forseps ile lamel merkezinde hafifçe bastırılır. Eksplantlarındaki B27 katkı maddeleri, 10 mM HEPES pH 7.4 ile tampon ve nemlendirilmiş bir 38 ° C inkübatör gecede yerleştirilen F12 orta kültür. Büyüme faktörleri gerektiği gibi kültür ortamı, katma olabilir. E7 DRG eklendi nörotrofinler olmadan eksplantlar nöronların aksonları uzatacaktır rağmen nörotrofinler genellikle, eski embriyolardan kültürlerin DRG eklenir. Nöral retinanın eksplantlarındaki olmadan bu kültür ortamında aksonlar uzatmakbüyüme faktörleri dding.
- Kültürler yeterli aksonal akıbet aşağıdaki prosedürü başlamadan önce izin vermek için en az 18 saat süreyle inkübe edilir.
3. Rodamin aktin Permeabilization Tampon Hazırlanması
- 138 mM KCl, 10 mM BORU, 3 mM EGTA, 4mm MgCl 2 ve% 1 BSA (pH = 6.9) içeren permeabilization tampon stok çözelti 4 ° C11 2 hafta kadar saklanabilir. Kullanmadan önce son bir konsantrasyon için aşağıdaki bileşenleri eklenir:% 0.025 'saponin, 0.1 mM ATP ve 100 nM Alexa-Florlu 350 Phalloidin.
- Ayrı bir çözüm de bu aynı bileşenleri kullanmak artı 0.45μM rodamin olmayan kas aktin çözüm dönüşümlü vortekslenmiş rodamin-aktin kümeleri çözmek için 5 dakika için tritrated hemen önce taze olarak hazırlanır ve ilk permeabilization adımı sırasında 1 dakika için vortekslenmiş tüp içinde polimerizasyonu önlemek için. Buna rağmen, tüp filament montaj Sorun devam ederse, çözüm kullanmadan önce santrifüj olabilir.
4. F-aktin Dikenli Ends üzerine rodamin-aktin Nöronal Kültürleri ve Ortaklığın Permeabilization
- DRG veya retina eksplantlar ile bir kültür çanak dikkatle inkübatör kaldırılır ve aşağıdaki adımları oda sıcaklığında yapılır.
- Çözümleri tüm değişiklikler dikkatle yapılmalıdır. Pipet lamel kenarında yer olmalıdır ve çözümler kaldırılır ve yavaş yavaş ve az güç ile eklenmelidir.
- Kültür ortamı dikkatle pipet tarafından kaldırılır, fakat istikrarlı ve hücreleri karşılamak için yeterli permeabilization tampon 1 dakika (18mm x 18mm lamel ~ 60 mcL) eklenir. Kültür permeabilization tampon eklemeden önce başka herhangi bir çözümleri ile durulanır ve lamel permeabilization tampon eklemeden önce kurumasına izin değildir.
- Permeabilization tampon yavaşça pipet tarafından kaldırılmış ve 4 dakika süreyle 0.45 mcM rodamin olmayan kas aktin içeren permeabilization tamponu ile değiştirilir.
- % 4 paraformaldehid (laboratuvar notu, fosfat tamponu, pH 7.3 ile yapılan),% 0.05 glutaraldehid ve% 10 sukroz bir çözüm ekleyerek rodamin-aktin içeren tampon hafifçe pipet tarafından kaldırılır ve nöronlar sabit. 5 dakika fiksasyon sonra lamelleri hafifçe PBS ile durulanır, ve 3-inç cam slaytlar Slowfade monte.
- Değişen çözümlere alternatif bir yaklaşım, bir akış hücresi kullanmaktır. Bu piyasada bulunan akış hücresi olabilir, ya da basit bir akış hücresi ayırıcılar olarak lamel köşelerinde küçük plastik parçaları (≤ 1 mm kalınlığında) koyarak ve daha sonra üst eşit büyüklükte bir lamel montaj olabilir lamel. Çözümler akışını hücrenin bir tarafında pipet yerleştirerek ve diğer tarafında bir fitil (pamuk veya Kimwipe) ile çözümler çekilerek değiştirilebilir.
- Üzerine rodamin-aktin, F-aktin dikenli sona erer ve büyüme konileri F-aktin floresan-Phalloidin etiketleme dahil, 60X immersiyon yağı hedefi ile epi-floresans optik ile görüntülendi ve görüntüleri soğutmalı bir CCD kamera kullanılarak toplanır. Konfokal mikroskop gelişmiş görüntüleme sağlayabilir.
- Rodamin-aktin dahil en iyi ölçümü için her görüntü için dijital kamera hassasiyeti aynı kazanç ve pozlama ayarlarını kullanarak tüm görüntüleri tek bir oturumda toplanan olmalıdır. Her görüntünün eşdeğer bölgelerden gelen etiketleme analizi yapılmalıdır; Metamorph, Resim J veya benzer bilgisayarlı görüntü analizi için araçlar kullanılabilir.
BU İŞLEMİ VE DEĞİŞİMLER
5. Bir Varyasyon: Canlı Hücre Görüntüler rodamin-aktin Etiketleme önce toplayın
- Video yemekler ısıtılmış bir mikroskop sahneye yerleştirilir, ve canlı büyüme konisinin görüntüleri toplanır. Izgara lamelleri kullanılabilir, ya da gravür ve / veya kalem işaretleri lamel etiketleme sonra belirli hücreleri bulmak için daha kolay yapılabilir, veya video çanak prosedürün süresi için mikroskop sahnede yerinde sabit olabilir.
- Rodamin-aktin Permeabilization, birleşme ve hücre sabitleme ya da mikroskop sahneden ya video çanak yapılır. Düzeltmeden sonra, PBS, hemen görüntüleme için video yemekleri eklenir. Daha sonra görüntüleme için örnek korumak için, slowfade montaj orta lamel eklenir ve eşit büyüklükte bir lamel yavaşça (baloncuklar kaçınarak) üstüne yerleştirilir ve kenarları, sonra da açık bir oje ile mühürlenir.
6. Varyasyon İki: Co-etiket Ek Proteinler İmmünokimya
- (4.2-4.4) Yukarıda açıklandığı gibi rodamin-aktin birleşme ve fiksasyon, lamelleri veya video yemekler kültüre nöronlar yapılabilir.
- Fiksasyon sonra, PBS içinde durulama, hücreler 15 dakika PBS içinde 0.1 M glisin ile tedavi edilen ve daha sonra çıkarılan% 0.1 Triton X-100, 1 saat süreyle% 2 keçi serum ve% 1 BSA ile PBS (TX-100) Lameller1 saat için% 1 BSA içeren PBS ile sulandırılmış primer antikorlar ile inkübe Lamelleri sonra durulanır ve 1 saat için% 1 BSA ile PBS 1:1000 dilüsyon floresan sekonder antikor uygulamadan önce% 2 keçi serum ve 1 saat süreyle% 1'lik BSA ile PBS TX-100,% 0.1 'inkübe Durulandıktan sonra, lamelleri tekrar 30 dakika süreyle% 2 keçi serum ve% 1 BSA ile% 0.1 TX-100 PBS içinde inkübe durulanır ve anti-solmaya orta monte edilmiş. Bazı proteinlerin lokalizasyonu, ilk permeabilization adım (4.3) tarafından bozulur. Bu proteinlerin antikorlar ile lokalizasyonu,% 0.05 paraformaldehid ve% 0.05 glutaraldehid korumak için dikenli rodamin-aktin sonuna etiketleme etkilemeden (rodamin-aktin eklemeden önce yani) 1 dk permeabilization tampona eklenmiş olabilir.
- Üçlü etiketli büyüme konileri Görüntüler floresan veya konfokal mikroskopi toplanır.
7. Varyasyon Üç: F-aktin Ücretsiz Dikenli Ends Rehberlik Cues Etkilerinin Değerlendirilmesi
- Bir büyüme faktörü veya rehberlik işaret inkübatör çanak kaldırılması ve permeabilization yordama başlamadan önce, birkaç dakika için birkaç ng / ml (ya da uygun bir tedavi süresi) konsantrasyonları inkübatör kültür yemekleri eklenir. Bu F-aktin ücretsiz dikenli ucunda büyüme faktörleri veya rehberlik ipuçları kısa vadeli etkilerinin değerlendirilmesi sağlar.
- Isınmış bir mikroskop sahnede yer nöronal kültürlerin bir video çanak ve büyüme faktörleri veya rehberlik ipuçları permeabilization ve rodamin aktin dahil başlamadan önce bir büyüme konisi yakınındaki bir degrade bir mikropipet serbest olabilir. Örneğin, NGF nöral retina ganglion hücrelerinin nöron veya Netrin DRG için serbest bırakılabilir. Pipet permeabilization prosedürü başlamadan önce 1-2 dakika gibi kısa bir sokulabilir. Bu büyüme konisi önde gelen marjları (resimler için referans atıf 10) F-aktin ücretsiz dikenli biter oluşumu üzerine bir hidayet işaret degrade yerel etkilerin değerlendirilmesi sağlar.
- Bu varyasyonlar, yukarıda 6.2 'de açıklandığı gibi, diğer nöronal bileşenleri antikor-aracılı etiketleme ile kombine edilebilir.
8. Varyasyon Dört: transfekte Nöronlar F-aktin Ücretsiz Dikenli Sona Etiketleme
- RNAi (floresan tanımlayıcı işaretleyici) ile yapısal olarak aktif ya da dominant-negatif yapıları veya protein demonte kullanımı F-aktin ücretsiz dikenli biter düzenleyen bir protein katılımı değerlendirmek için kullanılabilir. Protein, büyüme konisi içinde bulunduğu lokalizasyona bağlı olarak, floresan etiketi erimiş ise, transfekte hücreler, floresan ifade protein permeabilization üzerine kaybolmuş olabilir. Bu durumda, video yemekleri transfekte hücreli mikroskobik permeabilization önce bir tanımlamak için kullanılan olabilir ve permeabilization transfekte hücrelerinin konumları işaretleme sonra mikroskop sahnede yapılabilir. Alternatif olarak, GFP-aktin inşa ilgi GFP-inşa co-transfekte olabilir. Bu durumda, GFP-aktin F-aktin içine dahil olacak ve permeabilization sonra transfekte hücrelerinin kimlik sağlayan, permeabilization kayıp olmayacak.
- Bu değişim, yukarıda 7,1-7,3 açıklandığı gibi, rehberlik ipuçlarının ilavesi ile kombine edilebilir.
9 - Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. NGF, Küresel ek DRG bir büyüme konisinin 5 dakika boyunca sinir büyüme faktörü (NGF) ile uyarılır, aktin polimerizasyonu önde gelen marjı uyarılır. Toplam F-aktin ve büyüme konisinin önde gelen marjı F-aktin dikenli biter artar ve rodamin-aktin etiketleme parlak bir grup, büyüme konisi çevre etrafında görülür. Şekil 1 unstimulated DRG büyüme konisi ve NGF-uyarılmış DRG büyüme konisinin içine rodamin-aktin dahil karşılaştırır. Birleştirilen görüntülerin yeşil floresan Phalloidin büyüme konisinin etiketleme ve F-aktin kırmızı rodamin-aktin etiketleme. Dikenli sonuna etiketlenmesi için iyi bir kontrol, 4.2 ve 4.3 adımları permeabilization tampon 10-6 M veya daha yüksek cytochalasin B veya D eklemek için. Cytochalasins kap F-aktin dikenli biter ve dikenli biter rodamin-aktin bağlayıcı inhibe ederler. Bu ciddi rodamin-aktin hücre içine dahil azaltmak veya ortadan kaldırmak gerekir. Ölçek barlar, 10 mm.
Şekil 2. NGF degrade yerel F-aktin dikenli biter artar. Bültenleri NGF DRG büyüme konisi, F-aktin ücretsiz dikenli biter etiketleme 2 dakika boyunca bir tarafında getirilen olduğunu mikropipet. Aşağıdaki resimler NGF bir degrade yerel pipet yakın büyüme konisi bölgenin F-aktin ücretsiz dikenli biter artışa yol açar maruz kalmanın göstermektedir. Birleştirilen görüntünün yeşil Phalloidin gösterirve kırmızı rodamin-aktin. Ölçeği bar, 10 mm.
Şekil 3. Aktif ERM proteinler büyüme konisinin önde gelen marjı birikir. Phospho-Ezrin/Radixin/Moesin İmmünositokimyasal etiketleme (Perm), F-aktin ücretsiz dikenli biter . ERM yerelleştirme korumak için bir dakika süreyle ilk permeabilization tampon gluteraldehid (% 0.05) ve paraformaldehid (% 0.05) eklendi. Rodamin-aktin, kırmızı; PERM, yeşil; Phalloidin, mavi. Ölçeği bar, 10 mm.
Şekil 4. Aktin polimerizasyonu uyarılması aktif ERM proteinleri gerektirir. Grubuyla DRG'ler GFP-aktin ve GFP kontrolü plazmid ya da dominant-negatif Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) inşa birlikte transfekte edildi. GFP-aktin permeabilization sonra transfekte hücrelerinin belirlenmesini sağlar. Burada, NGF F-aktin dikenli biter etiketleme önce 5 dakika eklendi. DN ERM ile transfekte büyüme konisi, yakındaki bir untransfected büyüme konisi (alt paneller) ile tezat büyüme konisinin önde gelen marjı (alt-orta panel), ya da dikenli sonuna GFP kontrolü (üst orta panelde) seviyeleri azalttı. Rodamin-aktin, kırmızı, GFP-aktin, yeşil. Ölçek barlar, 10 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yöntemleri, büyüme konileri geçiş önde gelen marjı aktin hücre iskeletinin dinamik remodeling katılan hücresel bileşenlerinin zamansal ve mekansal çözünürlükte izin sundu. NGF veya Netrin gibi cezbedici molekülleri, hızla aktin filament polimerizasyonu teşvik etmek için Şekil 1 ve 2'de gösterildiği gibi aktin dikenli biter aktif ADF / cofilin 10 aktin filament kesilmesinin tarafından oluşturulan yerel bir artış, eylem olarak ortaya çıkıyor. Bu yöntem radixin, Şekil 3 ve 4 resimde bir ERM protein, büyüme konisi aracılık chemotropic tepkiler, ilgili diğer proteinler lokalizasyonu izin verir. Bu yöntemler aynı zamanda göç eden nöronlar, glial hücreler veya diğer hücre türleri aktin-tabanlı motilite düzenlemeyi analiz etmek için de uygulanabilir.
Büyüme konileri ya da diğer küçük hareketli yapıları hassas doğası, bu yöntemin kullanılması önemli bir sınırlama yoktur. Büyüme konisi önde gelen marjlar veya hücrelerin benzer hareketli bölgelerinde aktin filamentler ve plazma zarı dışında birkaç yapısal öğeleri içeren, böylece her adımda dikkatli olunmalıdır. Çözümler alışverişinde Hücre agrega veya eksplantlar, yüzey gerilimi değişiklikler bozulabilir. Protokolde belirtildiği gibi, değişen çözümler için lamelleri kenarında pipetler yerleştirmek için en iyi ve akış hücresi yüzey gerilimi sorunları ortadan kaldıracaktır.
Hareketli bölgelerde hücre aktin dikenli biter görselleştirmek için alternatif bir yöntem Ancak Ena / VASP veya miyozin X gibi dikenli sonunda bağlayıcı proteinlerin floresan analogları, ifade hücre transfeksiyon içerir, büyüme konisinin marjları aktin dinamikleri düzensiz ifade değişmiş olabilir Bu aktin düzenleyici proteinler.
Filopodia gibi güçlü lamellipodia olarak bu rodamin-aktin etiketleme yöntemi ile etiketlenmiş değildir. Permeabilization tamponunda bulunan floresan Phalloidin etiketli ve stabilize olmasına rağmen filopodia bozulabilir. Bu fark rodamin-aktin lamellipodial vs filopodial dahil görselleştirme dahil rodamin-aktin bir sayısal sınırlama yansıtıyor olabilir, ya da bu hareketli yapılarda protein kapaklama dikenli sonu varlığı bir fark olabilir. Bu F-aktin ADF / cofilin kesilmesinin gibi, bu yöntem ile ücretsiz dikenli sona erer etiketleme, etiketli dikenli biter yeni oluşturulan olup olmadığını ortaya çıkarmamaktadır yaptığı ek bir sınırlama tutarsa, ya da F-aktin kopmuş ama dikenli biter olup olmadığını proteinler başlığı dikenli sonu kaldırılması tarafından serbest bırakıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Dr James Bamburg ve bu çalışmalarda işbirliği için onun laboratuvar üyelerine teşekkür ediyorum. Bu çalışma NIH hibe HD19950, EY07133 ve Minnesota Tıp Vakfı'nın bağışları ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
