Summary
कल्पना करने के लिए और एफ actin यों neuronal विकास शंकु में कांटेदार समाप्त होता है एक विधि का वर्णन है. कांच coverslips पर न्यूरॉन्स संवर्धन के बाद, कोशिकाओं सैपोनिन युक्त एक समाधान के साथ permeabilized हैं. फिर, सैपोनिन rhodamine-actin युक्त बफर के साथ एक छोटी ऊष्मायन मुक्त actin कांटेदार समाप्त होता है पर फ्लोरोसेंट actin शामिल हैं.
Protocol
Rhodamine-actin लेबलिंग के लिए, न्यूरॉन्स गिलास 35 मिमी प्लास्टिक के बर्तन के तल में, या "वीडियो" व्यंजन में चिपके coverslips पर रखा coverslips पर सुसंस्कृत हैं.
1. Coverslips या "वीडियो" व्यंजन की तैयारी
- कई neuronal प्रकार खराब करने के लिए इन विट्रो substrates में में चिपकने वाला हैं. ग्लास coverslips, जो इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं के लिए पर्याप्त न्यूरॉन सब्सट्रेट आसंजन की अनुमति नहीं जब तक वे पर्याप्त रूप से साफ कर रहे हैं और तैयार हो सकता है. एसिड धोने और सफाई गिलास coverslips के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया पुस्तक संवर्धन तंत्रिका कोशिकाओं, बैंकर और Goslin द्वारा संपादित में वर्णित है. वैकल्पिक रूप से, coverslips, जो avidly सब्सट्रेट अणुओं बांध के लिए एक nitrocellulose कोटिंग 1.7 कदम और नीचे 1.8 में वर्णित है.
- ग्लास coverslips (जैसे 18 मिमी वर्गों या 24 मिमी हलकों) DH 2 हे में rinsed और जैविक के निशान हटाने के लिए सूखी गर्मी (≥ 225 ° सी) के रूप में संभव के रूप में लंबे समय (कई दिनों की न्यूनतम तीन महीने या उससे अधिक समय के लिए) में सुखा हुआ यौगिकों. 1.6 या 1.3 करने के लिए आगे बढ़ना वीडियो व्यंजन के लिए कदम जाओ.
- उच्च संकल्प videomicroscopy के लिए एक पतली स्पष्ट गिलास सब्सट्रेट बनाने के लिए, उचित व्यास परिपत्र छेद 35 या 50 मिमी प्लास्टिक पेट्री या टिशू कल्चर व्यंजन के नीचे एक बिजली काग छिद्रक (या इसी तरह के साधन) का उपयोग में drilled हैं. ड्रिलिंग धीरे प्रकाश प्लास्टिक खुर से बचने के दबाव के साथ किया जाता है. कैंची के साथ drilled छेद के किनारों scraped कर रहे हैं करने के लिए दोनों पक्षों पर एक चिकनी सतह बनाने के लिए.
- ग्लास coverslips टिशू कल्चर उपयोग के लिए साफ कर रहे हैं, के रूप में 1.1 या 1.2 में वर्णित है. Coverslips जगह में छेद पर चिपका रहे हैं, गैर विषैले सिलिकॉन मछलीघर सीमेंट (18x18mm coverslips के लिए, एक 12mm व्यास सा प्रयोग किया जाता है) का उपयोग. सीमेंट के 24 घंटे के लिए ठीक है.
- (निम्न चरणों का पालन बाँझ शर्तों का उपयोग किया जाता है) वीडियो व्यंजन बाँझ DH हे 2 के साथ 3 बार rinsed हैं और शुष्क हवा की अनुमति दी.
- Coverslips neuronal संस्कृति के लिए सब्सट्रेट के अणुओं के साथ लेपित हैं. सबसे पहले, coverslip सतह के साथ लेपित है (18x18 coverslip के लिए 250 μL) 100 μg / एमएल humidified 38 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4-8 बजे (या रात) के लिए पीबीएस में पाली-D-lysine का एक समाधान है. Coverslips हैं तो बाँझ DH 2 हे के साथ 3 बार rinsed अनबाउंड पाली - डी - lysine हटाने और शुष्क हवा करने की अनुमति दी . कई neuronal प्रकार पाली - डी lysine अकेले के साथ लेपित, अगर सीरम प्रोटीन संस्कृति के माध्यम में शामिल हैं coverslips पर सुसंस्कृत हैं. हालांकि, vivo परिस्थितियों में और अधिक प्रासंगिक परिणाम प्राकृतिक सब्सट्रेट अणुओं का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं. Laminin, fibronectin या L1 सीएएम (10-20 पीबीएस में μg / एमएल) के रूप में इन अणुओं के समाधान,, सीधे 4-8 बजे या रात भर के लिए पाली - डी - lysine लेपित coverslips के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन हम अपनी प्रयोगशाला में नियमित कोट कोशिका आसंजन अणुओं को लागू करने के लिए प्रोटीन सब्सट्रेट बंधन में वृद्धि से पहले nitrocellulose की एक पतली फिल्म के साथ तैयार coverslips.
- 100% amyl एसीटेट के 5 एमएल में 5 ग्राम nitrocellulose भंग करके एक 1% nitrocellulose समाधान करें. Coverslip करने के लिए इस समाधान की 10 μL लागू करें और धीरे यह सतह पर फैल गया. एयर सूखी 10 मिनट.
- 25 μg / एमएल laminin या 4 μg / एमएल L1 सीएएम पीबीएस में और nitrocellulose सतह पर प्रसार का एक समाधान के 250 μL लागू करें. Humidified 38 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर, aspirate सब्सट्रेट में 4 घंटे (या रात) को सेते हैं और तुरंत संस्कृति के माध्यम जोड़ने, तो सब्सट्रेट सूखी नहीं करता है.
2. Neuronal संस्कृति की तैयारी
- भ्रूण दिन 7 लड़की भ्रूण अंडे से हटा रहे हैं, और 100 मिमी पेट्री विच्छेदन के लिए 10% सीरम के साथ संस्कृति के माध्यम युक्त छाती और पेट से आंतरिक अंगों को निकालने के लिए, एक stereomicroscope का उपयोग बर्तन में रखा जाता है.
- भ्रूण तो मध्यम के साथ rinsed हैं और तरल माध्यम से एक 60 मिमी पकवान स्थानांतरित करने के लिए और आगे को हटाने और पृष्ठीय रूट (DRG) ganglia या तंत्रिका रेटिना के ऊतकों के explants तैयार dissected. तरीके के लिए आवेदन और सेल जीवविज्ञानी, Hollenbeck और Bamburg द्वारा संपादित: एक विस्तृत विच्छेदन वर्णन सेल बायोलॉजी, 71 मात्रा, न्यूरॉन्स में तरीके में पाया जा सकता है. DRG explants 1/2-whole ganglia और तंत्रिका रेटिना explants 1 या मिमी व्यास में कम कर रहे हैं.
- बाहरी ऊतकों की explants सफाई के बाद, व्यक्तिगत explants coverslips, जो मध्यम संस्कृति के साथ संस्कृति बर्तन में पहले से ही कर रहे हैं watchmakers संदंश के साथ चले गए हैं. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, explant धीरे coverslip संदंश के साथ आंदोलन को रोकने जबकि इनक्यूबेटर करने के लिए परिवहन के केंद्र के लिए दबाया जाता है. Explants F12 के माध्यम B27 additives, 10 7.4 पीएच मिमी HEPES के साथ buffered और humidified 38 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा रातोंरात के साथ सुसंस्कृत हैं. वृद्धि कारक है जोड़ा जा सकता है के रूप में की जरूरत संस्कृति के माध्यम से. Neurotrophins अक्सर पुराने भ्रूण से संस्कृतियों DRG के लिए जोड़ रहे हैं, हालांकि E7 DRG न्यूरॉन्स जोडी neurotrophins बिना explants से axons का विस्तार होगा. तंत्रिका रेटिना के Explants एक के बिना इस संस्कृति के माध्यम में axons का विस्तारवृद्धि कारकों dding.
- संस्कृतियों कम से कम 18 घंटे के लिए incubated रहे हैं प्रक्रिया नीचे शुरू होने से पहले पर्याप्त axonal परिणाम की अनुमति.
3. Rhodamine-actin Permeabilization बफर की तैयारी
- Permeabilization बफर युक्त 138 मिमी KCl, 10 मिमी पाइप, 3 मिमी EGTA, 4mm 2 MgCl, और 1% BSA (= पीएच 6.9) के एक शेयर समाधान के 2 सप्ताह के लिए किया जा सकता है 4 ° C11 पर रखा. बस का उपयोग करने से पहले, निम्नलिखित घटकों के एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ रहे हैं: 0.025% saponin, 0.1 मिमी एटीपी, और 100 Alexa fluor 350 phalloidin एनएम.
- एक अलग समाधान भी हौसले से बस ही इन घटकों के अलावा 0.45μM rhodamine गैर पेशी actin के समाधान एकांतर vortexed है और 5 से rhodamine-actin clumps भंग मिनट के लिए tritrated के साथ का उपयोग करने से पहले तैयार है, और 1 मिनट के लिए प्रारंभिक permeabilization चरण के दौरान vortexed ट्यूब में polymerization रोकने के लिए. यदि इस के बावजूद, ट्यूब में रेशा विधानसभा एक समस्या बनी हुई है, समाधान पूर्व centrifuged किया जा सकता है उपयोग करने के लिए.
4. Neuronal rhodamine-actin की संस्कृति और निगमन की एफ actin कंटीले रुप पर Permeabilization
- DRG या रेटिना explants के साथ एक संस्कृति डिश ध्यान इन्क्यूबेटर से निकाल दिया जाता है और कमरे के तापमान पर निम्न चरणों का प्रदर्शन कर रहे हैं.
- समाधान के सभी परिवर्तनों को ध्यान से किया जाना चाहिए. विंदुक टिप coverslip के किनारे पर रखा जाना चाहिए, और समाधान और हटाया जाना चाहिए और धीरे धीरे कम से कम बल के साथ जोड़ा.
- संस्कृति के माध्यम विंदुक द्वारा हटा दिया जाता है ध्यान से, लेकिन तेजी से, और कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त permeabilization बफर 1 मिनट (18mm x 18mm coverslip ~ 60 μL के लिए) के लिए जोड़ा जाता है. संस्कृति permeabilization बफर जोड़ने से पहले किसी भी अन्य समाधान के साथ नहीं rinsed है, और coverslip permeabilization बफर जोड़ने से पहले सूखे की अनुमति नहीं है.
- permeabilization बफर धीरे विंदुक द्वारा हटा दिया जाता है और permeabilization 4 मिनट के लिए 0.45 सुक्ष्ममापी rhodamine गैर पेशी actin युक्त बफर के साथ बदल दिया.
- rhodamine-actin युक्त बफर धीरे विंदुक द्वारा हटा दिया जाता है, और 4% (प्रयोगशाला ग्रेड, फॉस्फेट बफर, 7.3 पीएच के साथ बनाया) paraformaldehyde, glutaraldehyde 0.05% और 10% sucrose के एक समाधान जोड़कर न्यूरॉन्स तय कर रहे हैं. 5 मिनट निर्धारण के बाद धीरे coverslips पीबीएस के साथ rinsed हैं, और 3 इंच गिलास स्लाइड पर Slowfade में घुड़सवार.
- बदलते समाधान के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए एक प्रवाह सेल का उपयोग करने के लिए है. यह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह सेल हो सकते हैं, या coverslip के कोनों पर spacers के रूप में प्लास्टिक के छोटे टुकड़े (≤ 1 मिमी मोटी) रखकर एक सरल प्रवाह सेल बनाया जा सकता है, और तब के शीर्ष पर एक बराबर आकार coverslip बढ़ते coverslip. समाधान प्रवाह सेल के एक पक्ष में पिपेट रखने और दूसरे पक्ष पर एक बाती (कपास या एक Kimwipe) के साथ समाधान वापस लेने से विमर्श किया जा सकता है.
- एफ actin कांटेदार समाप्त होता है और विकास शंकु में एफ actin की फ्लोरोसेंट phalloidin लेबलिंग पर rhodamine actin की निगमन एक 60x तेल विसर्जन उद्देश्य के माध्यम से महामारी प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी के साथ कल्पना है, और छवियाँ एकत्र, एक ठंडा सीसीडी कैमरे का उपयोग कर. एक confocal खुर्दबीन में सुधार इमेजिंग प्रदान कर सकता है.
- Rhodamine-actin के समावेश की सबसे अच्छी मात्रा का ठहराव के लिए सभी छवियों को एक सत्र में एकत्र किया जाना चाहिए, एक ही लाभ और प्रत्येक छवि के लिए डिजिटल कैमरा संवेदनशीलता के प्रदर्शन सेटिंग्स का उपयोग कर. लेबलिंग का विश्लेषण प्रत्येक छवि के बराबर क्षेत्रों से बना होना चाहिए; Metamorph, छवि जम्मू या छवि विश्लेषण के लिए इसी तरह कम्प्यूटरीकृत उपकरण इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस प्रक्रिया के बदलाव
5. एक रूपांतर: लाइव सेल छवियाँ पहले rhodamine-actin लेबल लीजिए
- वीडियो व्यंजन एक गरम खुर्दबीन मंच पर रखा जाता है, और जीना विकास शंकु छवियों एकत्र कर रहे हैं. Gridded coverslips, इस्तेमाल किया जा सकता है या etchings और / या coverslip पर कलम चिह्नों के लिए और अधिक आसानी से लेबलिंग के बाद विशिष्ट कक्षों को खोजने बनाया जा सकता है, या वीडियो पकवान खुर्दबीन मंच पर जगह में किया जा सकता है प्रक्रिया की अवधि के लिए निर्धारित है.
- Rhodamine actin की Permeabilization निगमन, और सेल निर्धारण वीडियो डिश में आयोजित की जाती हैं, या तो पर या बंद खुर्दबीन मंच. फिक्सिंग के बाद, Pbs तत्काल इमेजिंग के लिए वीडियो व्यंजन के लिए जोड़ा जाता है. बाद में इमेजिंग के लिए नमूना संरक्षित करने के लिए, slowfade बढ़ते मध्यम coverslip जोड़ा जाता है और समान आकार के एक coverslip धीरे शीर्ष पर रखा है (बुलबुले से बचने के), और किनारों तो स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील कर रहे हैं.
6. दो रूपांतर: सह लेबल के अतिरिक्त प्रोटीन के लिए Immunochemistry
- Rhodamine actin के समावेश और निर्धारण coverslips पर या वीडियो बर्तन में सभ्य न्यूरॉन्स पर आयोजित किया जा सकता है, के रूप में ऊपर (4.2-4.4) में वर्णित है.
- निर्धारण के बाद, और PBS में rinsing, कोशिकाओं पीबीएस में 0.1 एम ग्लाइसिन के साथ 15 मिनट का इलाज कर रहे हैं और उसके बाद 0.1% के साथ निकाली ट्राइटन X-100 (TX-100) पीबीएस में 2% बकरी और एच. 1 के लिए 1% BSA सीरम के साथ Coverslipsप्राथमिक एंटीबॉडी पीबीएस में पतला 1 एच. के लिए 1% BSA युक्त के साथ incubated coverslips तो और rinsed 2% बकरी सीरम और 1 घंटे के लिए 1% BSA के साथ 0.1% में incubated पीबीएस में पीबीएस में 1:1000 कमजोर पड़ने पर एक एच. के लिए 1% BSA के साथ फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करने से पहले, TX-100 Rinsing के बाद, coverslips फिर से 2% बकरी और 30 मिनट के लिए 1% BSA सीरम के साथ 0.1% पीबीएस में TX-100 में incubated, rinsed, और विरोधी लुप्त होती मध्यम में मुहिम शुरू की. कुछ प्रोटीन का स्थानीयकरण प्रारंभिक permeabilization कदम (4.3) के द्वारा बाधित है. एंटीबॉडी के साथ स्थानीयकरण, 0.05% paraformaldehyde और 0.05% glutaraldehyde के लिए इन प्रोटीनों को बनाए रखने के लिए 1 मिनट के लिए permeabilization बफर जोड़ा जा सकता है (यानी rhodamine-actin जोड़ने से पहले) rhodamine-actin द्वारा कांटेदार अंत लेबलिंग को प्रभावित किए बिना.
- ट्रिपल लेबल विकास शंकु की छवियाँ प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एकत्र कर रहे हैं.
7. तीन रूपांतर: एफ actin मुफ्त कंटीले रुप पर मार्गदर्शन Cues के प्रभाव का आकलन
- वृद्धि कारक या मार्गदर्शन क्यू इनक्यूबेटर से पकवान हटाने और permeabilization प्रक्रिया की शुरुआत से पहले कुछ मिनट के लिए कई एनजी / एमएल (या एक उचित इलाज समय) की सांद्रता में इनक्यूबेटर में संस्कृति व्यंजन के लिए जोड़ा जाता है. यह विकास एफ actin मुक्त कांटेदार सिरों पर या कारकों मार्गदर्शन cues के अल्पकालिक प्रभाव का आकलन की अनुमति देता है.
- Neuronal संस्कृतियों के साथ एक वीडियो पकवान एक गरम खुर्दबीन मंच पर रखा जा सकता है, और वृद्धि कारकों या मार्गदर्शन cues permeabilization और rhodamine actin के समावेश की शुरुआत से पहले एक विकास शंकु के पास एक ढाल में एक micropipette से जारी किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, NGF तंत्रिका रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के लिए न्यूरॉन्स या netrin DRG के लिए जारी किया जा सकता है है. विंदुक permeabilization प्रक्रिया शुरू होने से पहले के रूप में कम के रूप में 1-2 मिनट के लिए पेश किया जा सकता है. यह एफ actin विकास शंकु अग्रणी मार्जिन (छवियों के लिए संदर्भ 10 प्रशस्ति पत्र देखें) में मुफ्त कांटेदार समाप्त होता है के गठन पर मार्गदर्शन क्यू ढाल के स्थानीय प्रभाव के आकलन की अनुमति देता है.
- इन बदलावों अन्य neuronal घटकों के एंटीबॉडी की मध्यस्थता, लेबलिंग के रूप में ऊपर 6.2 में वर्णित के साथ जोड़ा जा सकता है.
8. चार रूपांतर: एफ actin मुफ्त ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स पर कंटीले एंड लेबलिंग
- constitutively सक्रिय या प्रमुख नकारात्मक constructs या प्रोटीन पछाड़ना आरएनएआई (एक फ्लोरोसेंट पहचान मार्कर के साथ) का उपयोग कर का उपयोग करने के लिए एफ actin मुक्त कांटेदार समाप्त होता है को विनियमित करने में एक प्रोटीन की भागीदारी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विकास शंकु के भीतर प्रोटीन, उसके स्थानीयकरण पर निर्भर करता है, और अगर यह एक फ्लोरोसेंट टैग से जुड़े हुए है, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त permeabilization पर खो दिया जा सकता है. यदि यह मामला है, वीडियो व्यंजन permeabilization पहले microscopically ट्रांसफ़ेक्ट सेल की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और permeabilization खुर्दबीन मंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है है ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के पदों का अंकन करने के बाद,. वैकल्पिक रूप से, एक GFP-actin का निर्माण किया जा सकता है के साथ ब्याज की एक GFP-निर्माण सह ट्रांसफ़ेक्ट. इस मामले में, GFP-actin एफ actin में शामिल हो जाएगा, और नहीं खो जाएगा permeabilization द्वारा, permeabilization बाद ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान सक्षम है.
- इस परिवर्तन मार्गदर्शन cues के अलावा के साथ संयुक्त किया जा सकता है, के रूप में 7.1-7.3 ऊपर में वर्णित है.
9. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. NGF के ग्लोबल अलावा कुल एफ actin और विकास शंकु अग्रणी मार्जिन पर एफ actin कांटेदार समाप्त हो जाती है बढ़ जाती है जब एक DRG विकास शंकु तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) के साथ 5 मिनट के लिए प्रेरित है, actin polymerization के अग्रणी मार्जिन पर उत्तेजित है, और rhodamine-actin लेबलिंग के एक उज्ज्वल बैंड विकास शंकु परिधि के आसपास देखा है. चित्रा 1 एक unstimulated DRG विकास शंकु और एक NGF उत्तेजित DRG विकास शंकु में rhodamine-actin के समावेश की तुलना करती है. मर्ज किए गए चित्र में हरी प्रतिदीप्ति एफ actin के लिए विकास शंकु में phalloidin लेबलिंग और लाल rhodamine-actin लेबलिंग है. कांटेदार अंत लेबलिंग के लिए एक अच्छा नियंत्रण के लिए 4.2 और 4.3 चरणों में permeabilization बफर में 10-6 एम या उच्च cytochalasin बी या डी जोड़ने के लिए है. Cytochalasins एफ actin टोपी कांटेदार समाप्त होता है और rhodamine-actin कांटेदार समाप्त होता है के लिए बाध्य रोकना. यह गंभीर रूप से कम या सेल में rhodamine-actin के समावेश को खत्म करना चाहिए. स्केल सलाखों, 10 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2. एक NGF ढाल स्थानीय एफ actin कांटेदार समाप्त होता है एक micropipette कि विज्ञप्ति NGF 2 मिनट के लिए एक DRG विकास शंकु, एफ actin मुक्त कांटेदार समाप्त होता है लेबलिंग द्वारा पीछा के एक तरफ करने के लिए लाया जाता है बढ़ जाती है.. इस चित्र के नीचे NGF की एक ढाल स्थानीय रूप से एफ actin विकास शंकु विंदुक के लिए करीब क्षेत्र में मुक्त कांटेदार समाप्त होता है में वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए है कि जोखिम दिखा. मर्ज किए गए छवि हरे रंग में phalloidin दिखाता हैऔर लाल रंग में rhodamine-actin. स्केल बार, 10 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3. सक्रिय एर्म प्रोटीन विकास शंकु अग्रणी मार्जिन पर एफ actin मुक्त कांटेदार के साथ समाप्त होता है. Phospho-Ezrin/Radixin/Moesin के Immunocytochemical लेबलिंग (पेर्म) जमा. Gluteraldehyde (0.05%) और (0.05%) paraformaldehyde एर्म स्थानीयकरण संरक्षित मिनट के लिए प्रारंभिक permeabilization बफर करने के लिए जोड़ा गया था. Rhodamine-actin, लाल, पेर्म, हरे, phalloidin, नीले. स्केल बार, 10 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 4. Actin polymerization की उत्तेजना सक्रिय एर्म प्रोटीन की आवश्यकता है dissociated DRGs थे. GFP-actin और एक GFP नियंत्रण प्लाज्मिड या एक प्रमुख नकारात्मक एज़रिन / / Radixin Moesin (डी.एन. एर्म) का निर्माण के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट . GFP-actin के उपयोग permeabilization के बाद ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है. यहाँ, NGF एफ actin कांटेदार समाप्त होता है की लेबलिंग करने से पहले 5 मिनट में जोड़ा गया है. नोट: विकास डी.एन. एर्म के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोन विकास शंकु के प्रमुख (निचले मध्यम पैनल) मार्जिन, जो पास में एक untransfected विकास शंकु (कम पैनल) साथ contrasts या कांटेदार GFP नियंत्रण (ऊपरी मध्यम पैनल) के साथ अंत के स्तर में कमी आई है. Rhodamine actin, लाल, GFP-actin, हरे. स्केल सलाखों, 10 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत तरीकों सेलुलर घटक है कि actin cytoskeleton के गतिशील remodeling में विकास शंकु के पलायन के अग्रणी मार्जिन में शामिल कर रहे हैं के अस्थायी और स्थानिक संकल्प की अनुमति. NGF या netrin तरह attractant अणुओं, कार्रवाई करने के लिए तेजी से actin रेशा polymerization उत्तेजित actin कांटेदार समाप्त होता है में एक स्थानीय वृद्धि, सक्रिय एडीएफ / 10 cofilin द्वारा actin रेशा विच्छेद द्वारा बनाया, के रूप में आंकड़े 1 और 2 में दिखाया गया है के रूप में पता चला है. विधि अन्य mediating radixin, एर्म प्रोटीन, आंकड़े 3 और 4 में चित्र के रूप में विकास शंकु chemotropic प्रतिक्रियाओं, में शामिल प्रोटीन का स्थानीयकरण परमिट. इन तरीकों में भी पलायन न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं या अन्य प्रकार की कोशिकाओं में actin आधारित गतिशीलता के विनियमन का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है.
विकास शंकु या अन्य छोटे चलता - फिरता संरचनाओं के नाजुक प्रकृति इस विधि का उपयोग में एक महत्वपूर्ण सीमा है. विकास शंकु अग्रणी मार्जिन या कोशिकाओं के इसी तरह चलता - फिरता क्षेत्रों कुछ संरचनात्मक actin filaments और प्लाज्मा झिल्ली से अन्य तत्व होते हैं, तो देखभाल के हर कदम पर लिया जाना चाहिए. सेल समुच्चय या explants सतह के तनाव में परिवर्तन के द्वारा बाधित हो सकता है, समाधान के रूप में विमर्श कर रहे हैं. के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, यह सबसे अच्छा है के लिए समाधान को बदलने के लिए coverslips के किनारे पर pipettes जगह, और एक प्रवाह कक्ष के उपयोग की सतह तनाव से समस्याओं को समाप्त होगा.
कक्षों की गतिशील क्षेत्रों में actin कांटेदार समाप्त होता है कल्पना के लिए एक वैकल्पिक विधि सेल अभिकर्मक शामिल कांटेदार अंत बंधनकारी प्रोटीन की Ena / वीएएसपी या मायोसिन एक्स हालांकि जैसे फ्लोरोसेंट analogs, व्यक्त करने के लिए, actin के विकास शंकु हाशिये में गतिशीलता अनियमित अभिव्यक्ति के द्वारा बदला जा सकता इन actin नियामक प्रोटीन की.
Filopodia के रूप में यह लेबलिंग rhodamine actin विधि के रूप में lamellipodia हैं द्वारा जोरदार लेबल नहीं हैं. filopodia, बाधित हो सकता है हालांकि वे लेबल हैं और permeabilization बफर में निहित फ्लोरोसेंट phalloidin द्वारा स्थिर. Rhodamine actin की lamellipodial बनाम filopodial समावेश में यह अंतर शामिल rhodamine-actin के दृश्य में एक मात्रात्मक सीमा को प्रतिबिंबित हो सकता है, या कांटेदार चलता - फिरता इन संरचनाओं में प्रोटीन कैपिंग अंत की उपस्थिति में एक फर्क हो सकता है. यह एक अतिरिक्त सीमा है कि इस विधि के साथ मुक्त कांटेदार समाप्त होता है की लेबलिंग जैसे / ADF cofilin एफ actin की विच्छेद द्वारा प्रकट नहीं कि लेबल कांटेदार समाप्त होता है नव निर्मित करता है, उठाती है, या कि क्या एफ actin कटे लेकिन नहीं कांटेदार समाप्त होता है कांटेदार अंत को हटाने के प्रोटीन कैपिंग से मुक्त कर रहे हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखक डॉ. जेम्स Bamburg और इन अध्ययनों में सहयोग के लिए अपनी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं. इस काम एनआईएच HD19950 अनुदान, EY07133 और मिनेसोटा मेडिकल फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
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