Summary
Um método de visualizar e quantificar F-actina termina farpado em cones de crescimento neuronal é descrito. Depois de neurônios cultura em lamínulas, as células são permeabilizadas com uma solução contendo saponina. Em seguida, um de incubação curto com o buffer contendo saponina rodamina-actina incorpora actina fluorescente para fins de actina livre farpado.
Abstract
As pontas móveis de axônios em crescimento são chamados cones de crescimento. Cones de crescimento levam a navegar axônios através dos tecidos em desenvolvimento, interagindo com pistas expressas localmente orientação molecular que se ligam receptores cone de crescimento e regulam a dinâmica e organização do citoesqueleto cone de crescimento 3-6. O principal alvo desses sinais de navegação é a malha filamento de actina que enche a periferia cone de crescimento e que dirige a motilidade cone de crescimento através da polimerização de actina contínua e dinâmica remodelação 7. Pistas de orientação positiva ou atraentes induzir cone de crescimento transformando estimulando actina filamento (F-actina) polimerização na região da periferia do cone de crescimento que é mais perto da fonte do cue atrativo. Esta polimerização de actina unidades locais de crescimento cone protrusão de adesão, da margem de liderança e alongamento axonal em direção ao atrativo.
Polimerização de actina filamento depende da disponibilidade de monômero de actina suficiente e nos núcleos de polimerização ou termina filamento de actina farpado para a adição de monômero. Actina monômero é abundantemente disponível no pinto gânglio da raiz dorsal e da retina (DRG) cones de crescimento. Conseqüentemente, a polimerização aumenta rapidamente quando livre F-actina termina farpado ficam disponíveis para a adição de monômero. Isso ocorre no pinto DRG e cones da retina de crescimento através da ativação local da actina proteína F-actina cortando depolymerizing fator (ADF / cofilina) na região cone de crescimento mais perto de uma 80-10 atrativo. Esta atividade ADF / cofilina heightened severs filamentos de actina para criar novos F-actina termina farpado para polimerização. O método a seguir demonstra esse mecanismo. Conteúdo total de F-actina é visualizado através da coloração com phalloidin fluorescente. F-actina termina farpado são visualizados através da incorporação de rodamina-actina dentro de cones de crescimento que são permeabilizadas com o procedimento descrito a seguir, que é adaptado a partir de estudos anteriores de outras células móveis 11, 12. Quando rodamina-actina é adicionado em uma concentração acima da concentração crítica para além de monômero de actina para fins farpado, rodamina-actina monta para livre termina farpado. Se a sugestão atraente é apresentado em um gradiente, como sendo liberados a partir de uma micropipeta posicionada para um lado de um cone de crescimento, a incorporação de rodamina-actina em F-actina termina farpado será maior no lado cone de crescimento para a micropipeta 10 .
Cones de crescimento são estruturas celulares pequenas e delicadas. Os procedimentos de permeabilização rodamina-actina fixação incorporação, e visualização de fluorescência são cuidadosamente feito e pode ser realizada no palco de um microscópio invertido. Estes métodos podem ser aplicados ao estudo de polimerização de actina locais nos neurônios migrar, outras células do tecido primário ou linhas celulares.
Protocol
Para rodamina-actina rotulagem, os neurônios são cultivadas em lamínulas colocado no fundo de 35 pratos de plástico mm, ou em lamelas coladas em "video" pratos.
1. Preparação de Lamelas ou "Vídeo" Pratos
- Muitos tipos de neurônios são mal adesivo in vitro substratos. Lamínulas de vidro, que são necessários para este procedimento, podem não permitir a adesão neurônio-substrato suficiente a menos que sejam adequadamente limpo e preparado. Um procedimento detalhado para o ácido da lavagem e limpeza lamínulas de vidro é descrito no livro a cultura de células nervosas, editado por Banker e Goslin. Alternativamente, um revestimento de nitrocelulose para lamínulas, que avidamente se liga as moléculas de substrato, é descrito nos passos 1.7 e 1.8 abaixo.
- Lamínulas de vidro (por exemplo, 18 mm ou 24 praças círculos mm) são lavados em dH 2 O e cozido em calor seco (≥ 225 ° C) o maior tempo possível (mínimo de vários dias até três meses ou mais) para remover traços de orgânicos compostos. Vá para o passo 1.6 ou para pratos de vídeo proceder a 1,3.
- Para criar um substrato de vidro fina e clara para videomicroscopia de alta resolução, orifícios circulares de diâmetro adequado são perfurados no fundo dos 35 ou 50 Petri de plástico mm ou placas de cultura de tecido usando uma broca elétrica de cortiça (ou instrumento similar). Perfuração é feita lentamente, com uma leve pressão para evitar a quebra do plástico. Bordas do buraco perfurado são raspadas com uma tesoura para criar uma superfície lisa em ambos os lados.
- Lamínulas de vidro são limpos para o uso de cultura de tecidos, como descrito em 1.1 ou 1.2. Lamínulas são colados no local sobre os buracos, usando non-toxic cimento aquário silicone (para lamínulas 18x18mm, um pouco 12mm de diâmetro é usado). O cimento é curado por 24 horas.
- (Os passos seguintes são feitos usando condições estéreis) Os pratos são lavados video 3 vezes com dH 2 O estéril e permitiu secar ao ar.
- Lamínulas são revestidos com moléculas de substrato para a cultura neuronal. Em primeiro lugar, a superfície é revestida com lamínula (250 mL de 18x18 lamela) uma solução de 100 mg / mL poli-D-lisina em PBS por 4-8 horas (ou noite) em um umidificado 38 ° C incubadora. Lamínulas são então enxaguadas 3 vezes com dH 2 O estéril para remover unbound poli-D-lisina e secas ao ar. Muitos tipos de neurônios são cultivadas em lamínulas revestidas com poli-D-lisina sozinho, se as proteínas do soro estão incluídos no meio de cultura. No entanto, os resultados mais relevantes para as condições in vivo são obtidos usando moléculas de substrato natural. Soluções destas moléculas, tais como laminina, fibronectina ou CAM L1 (1-20 mcg / mL em PBS), podem ser diretamente aplicadas a poli-D-lisina lamínulas revestido por 4-8 horas ou durante a noite, mas no nosso laboratório, rotineiramente revestimento do lamínulas preparadas com uma fina película de nitrocelulose antes de aplicar moléculas de adesão celular para aumentar a proteína-substrato de ligação.
- Faça uma solução de nitrocelulose 1% dissolvendo 5 g de nitrocelulose em 5 mL de 100% acetato de amila. Aplicar 10 mL desta solução para as lamelas e delicadamente espalhe sobre a superfície. Ar seco de 10 minutos.
- Aplicar 250 L de uma solução de 25 mg / mL laminina ou 4 mg / mL L1 CAM em PBS e espalhar sobre a superfície de nitrocelulose. Incubar 4 horas (ou noite) em um umidificado 38 ° C incubadora, substrato aspirado e imediatamente adicionar meio de cultura, de modo que o substrato não seque.
2. Preparação das Culturas Neuronal
- Embrionárias dia 7 embriões de galinha são removidos a partir de ovos, e colocado em 100 milímetros pratos petri contendo meio de cultura com soro de 10% para dissecção para remover os órgãos internos do tórax e abdome, utilizando um estereomicroscópio.
- Os embriões são então enxaguadas com o meio e se mudou para um prato de 60 milímetros com meio líquido e posteriormente dissecadas para retirada e preparar explantes de gânglios da raiz dorsal (DRG) ou tecidos neurais da retina. Uma descrição detalhada dissecação pode ser encontrado em Métodos em Biologia Celular, volume 71, Neurônios: Métodos e Aplicações para a biologia celular, editado por Hollenbeck e Bamburg. Explantes DRG são gânglios 1/2-whole e neural explantes da retina são de 1 mm ou menos de diâmetro.
- Após a limpeza dos explantes de tecidos estranhos, explantes individuais são movidos com uma pinça para relojoeiros as lamelas, que já estão em placas de cultura com o meio de cultura. Sob um microscópio de dissecação, o explante é delicadamente pressionado para o centro da lamela com uma pinça para evitar a movimentação durante o transporte para a incubadora. Explantes são cultivados em meio com B27 F12 aditivos, tamponado com HEPES 10 mM de pH 7,4 e colocado durante a noite em um umidificado 38 ° C incubadora. Fatores de crescimento podem ser adicionados, conforme necessário, para o meio de cultura. Neurotrofinas são muitas vezes adicionados aos DRG culturas a partir de embriões mais velhos, embora E7 neurônios DRG vai estender axônios a partir de explantes sem neurotrofinas acrescentou. Explantes de retina neural estender axônios neste meio de cultura semdding fatores de crescimento.
- Culturas são incubadas por pelo menos 18 horas para permitir crescimento axonal suficiente antes de começar o procedimento abaixo.
3. Preparação de Rodamina actina-Buffer permeabilização
- A solução estoque de tampão contendo 138 mM permeabilização KCl, 10 mM PIPES, 3 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, e BSA 1% (pH = 6.9) pode ser mantida até 2 semanas a 4 ° C11. Imediatamente antes da utilização, os seguintes componentes são adicionados para uma concentração final de: saponina 0,025%, 0,1 mM de ATP, e 100 nM Alexa-fluor 350 phalloidin.
- Uma solução separada também é preparada imediatamente antes da utilização com estes mesmos componentes, mais 0,45 rodamina actina muscular não-A solução é alternadamente agitadas e tritrated por 5 minutos para dissolver rodamina actina-aglomerados, e é agitadas durante 1 min durante a etapa de permeabilização inicial para evitar a polimerização no tubo. Se, apesar disso, a montagem de filamento do tubo continua sendo um problema, a solução pode ser centrifugadas antes do uso.
4. Permeabilização das Culturas Neuronal e Incorporação de Rodamina-actina em F-actina Termina farpado
- A placa de cultura com explantes DRG ou da retina é cuidadosamente removida da incubadora e os passos seguintes são realizados à temperatura ambiente.
- Todas as alterações das soluções deve ser feito com cuidado. A ponta da pipeta deve ser colocada na borda da lamínula, e as soluções devem ser removidos e adicionados lentamente e com pouca força.
- O meio de cultura é removido com uma pipeta com cuidado, mas firmemente, e buffer de permeabilização suficiente para cobrir as células é adicionado para 1 min (para lamela x 18mm 18mm, ~ 60 mL). A cultura não é lavado com outras soluções antes de adicionar o buffer de permeabilização, e as lamelas não é permitida para secar antes de adicionar o buffer de permeabilização.
- O buffer de permeabilização é gentilmente removido com uma pipeta e substituído pelo tampão contendo 0,45 mM permeabilização rodamina actina não-músculo por 4 min.
- A rodamina-actina contendo tampão é gentilmente removido com uma pipeta, e os neurônios são fixadas pela adição de uma solução de paraformaldeído a 4% (qualidade laboratorial, feito com tampão fosfato, pH 7,3), glutaraldeído 0,05% e sacarose 10%. Após a fixação cinco minutos as lamelas são delicadamente lavados com PBS e montadas em Slowfade em lâminas de vidro de 3 polegadas.
- Uma abordagem alternativa para soluções de mudança é a utilização de uma célula de fluxo. Esta pode ser uma célula de fluxo disponíveis comercialmente, ou uma célula de fluxo simples pode ser feita colocando pequenos pedaços de plástico (≤ 1 mm de espessura) como espaçadores nos cantos da lamínula, e então montar uma lamínula de mesmo tamanho na parte superior da lamela. Soluções podem ser trocados por colocar a pipeta em um dos lados da célula de fluxo e retirada soluções com um pavio (algodão ou um Kimwipe) no outro lado.
- A incorporação de rodamina-actina em F-actina termina farpado e fluorescente-phalloidin rotulagem de F-actina em cones de crescimento é visualizado com epi-fluorescência óptica através de um objetivo 60X óleo de imersão, e as imagens são coletados, usando uma câmera CCD refrigerado. Um microscópio confocal pode fornecer imagens melhoradas.
- Para melhor quantificação da rodamina-actina incorporação de todas as imagens devem ser recolhidos em uma única sessão, usando o mesmo ganho e as configurações de exposição da sensibilidade da câmera digital para cada imagem. Análise de rotulagem deve ser feita a partir de regiões equivalentes de cada imagem; Metamorph, Image J ou similar ferramentas informatizadas para análise de imagens pode ser usado.
Variações deste PROCEDIMENTO
5. Uma variação: Colete Imagens Live Cell Antes de Rodamina actina-Labeling
- Pratos de vídeo são colocadas em um estágio do microscópio aquecida, e as imagens ao vivo cone de crescimento são coletados. Lamínulas em grade pode ser usado, ou gravuras e / ou marcas de caneta na lamela pode ser feita para encontrar mais facilmente células específicas após a rotulagem ou o prato de vídeo pode ser fixado no lugar no estágio do microscópio para a duração do procedimento.
- Incorporação permeabilização, de rodamina-actina, e fixação de células são conduzidas no prato de vídeo, dentro ou fora do palco microscópio. Após a fixação, PBS é adicionado a pratos de vídeo para imagens imediatas. Para preservar a amostra para imagens mais tarde, slowfade meio de montagem é adicionado à lamela e uma lamela de igual tamanho é suavemente colocado em cima (evitar bolhas), e as bordas são seladas com unhas polonês claro.
6. Variação dois: Imunoquímica de Proteínas Co-label adicionais
- Rodamina actina-incorporação e fixação pode ser realizada em neurônios cultivados em lamelas ou em pratos de vídeo, como descrito acima (4,2-4,4).
- Após a fixação e lavagem em PBS, as células são tratados 15 min com 0,1 M de glicina em PBS e, em seguida, extraída com 0,1% Triton X-100 (TX-100) em PBS com soro de cabra 2% e BSA 1% durante 1 h. Lamínulassão incubadas com os anticorpos primários diluídos em PBS contendo BSA 1% durante 1 h. As lamelas são então lavados e incubados em 0,1% TX-100 em PBS com soro de cabra 2% e BSA 1% durante 1 h, antes de aplicar fluorescentes anticorpos secundários na diluição 1:1000 em PBS com BSA 1% durante 1 h. Após a lavagem, as lamelas são novamente incubadas em 0,1% TX-100 em PBS com soro de cabra 2% e BSA 1% por 30 min, lavadas, e montados em anti-fading médio. A localização de algumas proteínas é interrompida pela etapa inicial permeabilização (4.3). Para manter estas proteínas para localização com anticorpos, paraformaldeído e glutaraldeído 0,05% 0,05% pode ser adicionado ao buffer permeabilização por 1 min (isto é, antes de adicionar o rodamina-actina) sem afetar a rotulagem final farpado por rodamina-actina.
- Imagens de cones de crescimento triple-rotulados são recolhidos por microscopia de fluorescência confocal ou.
7. Variação Três: Avaliação dos Efeitos da Cues Orientação sobre extremidades livres F-actina farpado
- Um fator de crescimento ou sugestão orientação é adicionado a placas de cultura na incubadora, em concentrações de vários ng / mL por alguns minutos (ou um tempo de tratamento apropriado) antes de retirar o prato da incubadora e iniciar o procedimento de permeabilização. Isto permite a avaliação dos efeitos de curto prazo de fatores de crescimento ou pistas de orientação sobre extremidades livres F-actina farpado.
- Um prato de vídeo com as culturas de neurônios pode ser colocado em um estágio do microscópio aquecida, e fatores de crescimento ou pistas de orientação podem ser liberados a partir de uma micropipeta em um gradiente próximo a um cone de crescimento antes de começar a permeabilização e rodamina actina-incorporação. Por exemplo, NGF pode ser liberado para DRG neurônios ou netrin de células ganglionares da retina neural. A pipeta pode ser introduzida para tão curto quanto 1-2 minutos antes de iniciar o procedimento de permeabilização. Isto permite a avaliação dos efeitos locais de um gradiente de cue orientação sobre a formação de extremidades livres F-actina farpado nas margens de crescimento cone principal (ver citação de referência 10 para imagens).
- Estas variações podem ser combinados com mediada por anticorpos rotulagem de outros componentes neuronal, como descrito em 6.2 acima.
8. Quatro variação: F-actina Labeling extremidade livre farpado em Neurônios Transfectados
- O uso de construções constitutivamente ativa ou dominante-negativo ou knockdown proteínas usando RNAi (com um marcador fluorescente identificar) pode ser usado para avaliar o envolvimento de uma proteína na regulação da F-actina livre termina farpado. Dependendo da proteína, sua localização dentro do cone de crescimento, e se ele é fundido a uma etiqueta fluorescente, a proteína fluorescente expressa em células transfectadas pode ser perdida após permeabilização. Se este for o caso, pratos de vídeo pode ser usado para identificar uma célula transfectadas microscopicamente antes de permeabilização ea permeabilização pode ser realizada no palco microscópio, depois de marcar as posições das células transfectadas. Alternativamente, uma construção GFP-actina pode ser co-transfectadas com GFP-um constructo de interesse. Neste caso, GFP-actina serão incorporados F-actina, e não será perdida por permeabilização, permitindo a identificação de células transfectadas após permeabilização.
- Esta variação pode ser combinada com a adição de pistas de orientação, conforme descrito no 7,1-7,3 acima.
9. Resultados representante
Figura 1. Além global de NGF aumentos totais F-actina e F-actina termina farpado na margem cone de maior crescimento. Quando um cone de crescimento DRG é estimulado com fator de crescimento neural (NGF) por 5 minutos, polimerização de actina é estimulada na margem principal, e uma banda de rodamina-actina rotulagem é visto em torno da periferia do cone de crescimento. A Figura 1 compara rodamina-actina incorporação em um cone unstimulated DRG crescimento e uma NGF estimulada cone de crescimento DRG. A fluorescência verde nas imagens fundidas é phalloidin rotulagem de F-actina no cone de crescimento eo vermelho é rodamina-actina rotulagem. Um bom controle de rotulagem final farpado é adicionar 10-6 M ou superior citocalasina B ou D no buffer de permeabilização nos passos 4.2 e 4.3. Citocalasinas cap F-actina termina farpado e inibir rodamina actina-binding para fins farpado. Isso deve reduzir drasticamente ou eliminar a incorporação de rodamina-actina na célula. Barra de escala, 10 mM.
Figura 2. Um gradiente de NGF localmente aumenta a F-actina termina farpado. A micropipeta que libera NGF é trazido para um lado de um cone de crescimento DRG por 2 minutos, seguido de rotulagem de F-actina livre termina farpado. As imagens abaixo mostram que a exposição a um gradiente de NGF localmente estimula um aumento na extremidades livres F-actina farpado na região cone de crescimento mais perto da pipeta. A imagem mesclada mostra phalloidin em verdee rodamina-actina em vermelho. Barra de escala, 10 mM.
Figura 3. ERM proteínas ativadas acumulam na margem cone de maior crescimento. Rotulagem imunocitoquímico de phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (PERM) com extremidades livres F-actina farpado. Gluteraldehyde (0,05%) e paraformaldeído (0,05%) foram adicionados ao tampão de permeabilização inicial para uma min para preservar a localização de ERM. Rodamina-actina, vermelho, PERM, verde; phalloidin, azul. Barra de escala, 10 mM.
Figura 4. Estimulação da polimerização de actina requer proteínas ERM ativo. DRGs Dissociated foram co-transfectadas com GFP-actina e um controle GFP plasmídeo ou um dominante negativo Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) construir. O uso de GFP-actina permite a identificação de células transfectadas após permeabilização. Aqui, NGF foi adicionado 5 min antes de rotulagem de F-actina termina farpado. Observe o cone de crescimento transfectadas com DN ERM tem reduzido os níveis de final farpado na margem cone de crescimento inicial (painel inferior do meio), o que contrasta com um cone de crescimento próxima untransfected (painéis inferiores), ou com o controle GFP (painel de média alta). Rodamina-actina, vermelho; GFP-actina, verde. Barra de escala, 10 mM.
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Discussion
Os métodos aqui apresentados permitem resolução temporal e espacial de componentes celulares que estão envolvidos na remodelação dinâmica do citoesqueleto de actina na margem líder de migração cones de crescimento. A ação das moléculas de atrativo, como NGF ou netrin, para estimular rapidamente a polimerização de actina filamento é revelado como um aumento local na actina termina farpado, criado por actina cortando filamento ativado ADF / cofilina 10, como mostrado nas Figuras 1 e 2. O método permite a localização de outras proteínas envolvidas na mediação de crescimento respostas cone quimiotrópicas, como radixin, uma proteína de ERM, retratada nas Figuras 3 e 4. Estes métodos também podem ser aplicadas para analisar a regulamentação da actina baseado motilidade em neurônios migrar, células gliais ou outros tipos celulares.
A natureza delicada de cones de crescimento ou outras pequenas estruturas móveis é uma limitação significativa no uso deste método. Margens de crescimento cone principal ou similar regiões móveis de células contêm poucos elementos estruturais diferentes filamentos de actina e da membrana plasmática, por isso é preciso ter cuidado a cada passo. Agregados celulares ou explantes podem ser interrompidos por mudanças na tensão superficial, como as soluções são trocadas. Como mencionado no protocolo, o melhor é colocar pipetas na borda da lamínulas para a mudança de soluções, bem como a utilização de uma célula de fluxo eliminaria os problemas de tensões superficiais.
Um método alternativo para visualizar termina actina farpado em regiões móveis de células envolve transfecção de células para expressar análogos fluorescentes de farpado final proteínas de ligação, como Ena / VASP ou X. No entanto miosina, actina dinâmica das margens do cone de crescimento pode ser mudado pela expressão não regulamentada dessas proteínas reguladoras de actina.
Filopodia não são tão fortemente marcados por este método de marcação rodamina-actina como são lamellipodia. O filopodia poderá ser interrompida, apesar de serem rotulados e estabilizado pela phalloidin fluorescente contidos no buffer permeabilização. Esta diferença na incorporação vs lamellipodial filopodial de rodamina-actina pode refletir uma limitação quantitativa a visualização dos incorporadas rodamina-actina, ou pode haver uma diferença na presença de nivelamento final farpado proteínas nestas estruturas móveis. Isso levanta uma limitação adicional que a rotulagem de livre termina farpado com este método não revela se as extremidades rotuladas farpado são recém-criados, como por ADF / cofilina corte de F-actina, ou se F-actina não é cortada, mas acaba farpado são libertados pela remoção de final farpado nivelamento proteínas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. James Bamburg e membros de seu laboratório para a colaboração nestes estudos. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH HD19950, EY07133 e por concessões do Minnesota Medical Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
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