Summary
Det är allmänt känt att mekaniska krafter i kroppen kan påverka celldifferentiering och spridning. Här presenterar vi en video protokoll som visar användningen av en specialbyggd bioreaktor för att leverera enaxlig belastning cykliska drag till stamceller odlade på flexibla micropatterned substrat.
Abstract
Roll mekaniska krafter i utveckling och underhåll av biologiska vävnader är väl dokumenterat, bland annat flera mekaniskt reglerade företeelser som benremodellering, muskulös hypertrofi och glatt muskulatur cell plasticitet. Men de inblandade krafterna är ofta oerhört komplexa och svåra att övervaka och styra in vivo. För att bättre undersöka effekterna av mekaniska krafter på celler har vi utvecklat en in vitro-metod för tillämpning av enaxlig belastning cykliska drag att anhängare celler odlade på elastiskt membran. Denna metod använder en specialdesignad bioreaktor med en motordriven kam-rotor för att tillämpa önskad kraft. Här presenterar vi en steg-för-steg video protokoll visar hur man monterar de olika komponenterna i varje "stretch kammare", även i detta fall, en silikon membran med micropatterned topografi att orientera cellerna med ledning av stammen. Vi beskriver även förfaranden för sterilisering av kamrarna, sådd celler på membranet, låsning kammaren i bioreaktor, och justering av mekaniska parametrar (dvs. storlek och graden av ansträngning). De förfaranden som beskrivs i detta protokoll är specifika för sådd mänskliga mesenkymala stamceller på silikon membran med 10 mikrometer breda kanaler orienterade parallellt med riktningen av påfrestningar. Men de metoder och material som presenteras i detta system är flexibla nog att rymma ett antal variationer på detta tema: töjningshastighet, omfattning, varaktighet, celltyp, membran topografi, membran beläggning, etc. allt anpassas till önskat program eller resultat. Detta är en robust metod för att undersöka effekterna av enaxlig drag stam tillämpas på celler in vitro.
Protocol
Dag 0 - Sterilisering innan dagen av experiment
- Placera material i plastbalja och sterilisera med 70% alkohol i 2 timmar:
- Chambers
- Lock
- Ramar (alla 3 stycken)
- Skruvar
- Gummipackningar
- Tång
- Saxar
- Hex nycklar
- Rengör membran med Aquet tvål och destillerat vatten.
- Sonikera membran i 70% alkohol i 10 minuter.
- Placera de rena membranen i plast kvadrat rätter. Om du använder mönstrade membran, se till att den mönstrade är vänd uppåt (spray alkohol på ena sidan av membranet och se till att vätskan rinna ner i spåren).
- Lämna membran täckt av 70% alkohol i 2 timmar.
- Paket handskar i aluminiumfolie för autoklavering i morgon bitti.
- Gör 2% (vikt / volym) gelatin lösning (2g/100mL) i destillerat vatten för autoklavering i morgon.
- Efter 2 timmar sterilisering i 70% alkohol, placera alla polymera material och membran (icke-autoklaverbara material) i huva för övernattning UV:
- Chambers
- Lock
- Ramar (alla 3 stycken)
- Membranes
- Packa återstående material till autoklaverbara påse:
- Skruvar
- Gummipackningar
- Tång
- Saxar
- Hex nycklar
Dag 1 - Montering av sträckan kammare
- Autoklav pincett, sax, hex skiftnycklar, skruvar, packningar, handskar, och gelatin med hjälp av små autoklav vid 240 ° C i 20 minuter totalt
- Ta bort membran från UV och behandla med O 2 plasma (mönstrade uppåt) för ~ 1 minut.
- I TC huva, täcker mönstrad yta av plasma som behandlats membran med gelatin. Coat 30 för minuter under UV.
- Tvätta varje membran med PBS 2X. Efter 2: a tvätta, lämna några PBS på membran för att hålla dem hala, för enklare montering i kamrarna. (Skulle också använda denna PBS att smörja packningar för enklare montering).
- Montera membran i kammare (slitage autoklaveras handskar vid montage)
- Anslut de två viktigaste bitarna i ramen med en enda skruv.
- Vänd ramen och sätt ett membran på ovansidan så att gelatin-belagda sidan är vänd mot ramen (det mönstrade området bör i mitten).
- Fäst membranet i ramen med hjälp av en packning på varje sida.
- Tryck på packningar i, med hjälp av mjuka, jämnt tryck, för att inte slita på membranet.
- Fäst ihop ram till T-bar.
- Vänd ramen och lägg in i kammare upp och ner. UV baksidan av ram-och membran i 30 minuter
- Vänd ramen igen, och skruva i kammare (ingen förändring för kontroll kammare, men för sträcka kammare, måste använda två skruvar för att fästa slutet bit av ramen till botten av kammaren, och måste ta bort den enda skruv som är hålla de två delarna av ramen tillsammans). UV framsidan i 30 min. Se till att membranen är helt torra innan du fortsätter till nästa steg, annars cellen lösningen kan glida av vid sådd.
- Seed celler. Ett område med 1 platta = område med 3 membran, så använd 1 / 3 av en sammanhängande platta per membran. Använd 1 ml av cell-lösning per membran. Mer än 1,5 mL kommer att vara svårt att hålla lösning på. Sätt cell lösning endast på mönstrade området, och använda pipettspetsen att sprida lösningen runt. Täck kammare och låt celler fäster i 30 minuter RT i huven.
- Flytta kammare till inkubatorn och låt celler fäster till en mer timme. Var mycket försiktig att flytta kamrarna att inte låta cellen lösning glida av! Cellerna i denna avdelning kommer att förstöras om lösningen faller av på denna punkt.
- Återgå kammaren till huva och tillsätt 20 ml medier.
- Placera kamrarna i alkohol rensade badkar som är täckt med aluminiumfolie (också besprutas med alkohol). Flytta kammare att sträcka inkubator (10% CO 2).
- Säkert kamrarna i sträck maskin. Låt cellerna ytterligare bifoga en natt, och börjar sträcka på nästa dag. (OBS: när du lägger kamrarna i sträck maskin, kom ihåg att låsa maskinen i "noll"-läge innan du placerar kammare, och sedan dra åt gummiband runt växlarna Glöm inte att låsa upp växlarna innan maskinen startas.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Banes et al. först rapporterade användning av ett system för mekanisk stimulering av celler in vitro med hjälp av en flexibel elastomerisk substrat för att leverera mekanisk kraft till celler 1. Sedan dess har många variationer på denna design tagits fram och utnyttjas. Flera mekaniska stretch-system finns kommersiellt tillgängliga under namnet "Flexercell" (Flexcell International Corp), medan vissa laboratorier använder specialbyggda enheter. I den här videon protokoll vi har beskrivit installationen och användningen av en sådan enhet i vårt laboratorium.
Den specialbyggda "stretch maskin" skildras i detta protokoll har använts i olika studier för att undersöka effekterna av enaxlig cykliska påfrestningar på olika celltyper 2,3. Denna maskin är en mångsidig apparat med flera justerbara parametrar som kan användas för en mängd olika mekaniska påfrestningar studier. Installationsprogrammet avbildas här är en unik och robust metod för att enaxlig cykliska påfrestningar till anhängare celler i kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
