Summary
Мы представляем порядок изготовления и эксплуатации микрофлюидных устройство, которое воссоздает гетерогенной опухоли микроокружения
Abstract
Мы разработали микрофлюидных устройство, которое имитирует доставки и системный клиренс препаратов для гетерогенных трехмерной опухолевой ткани в пробирке. Питательные вещества доставляются на сосудистую не в состоянии охватить все районы опухоли, что приводит к гетерогенным микросреды, состоящей из жизнеспособных, покоя и некротические типов клеток. Многие лекарства от рака не в состоянии эффективно проникать и лечения всех типов клеток из-за этой неоднородности. Монослои раковые клетки не имитировать эту неоднородность, что делает его трудным для тестирования противораковых препаратов с подходящей моделью в пробирке. Наши микрофлюидных устройства были изготовлены из PDMS помощью мягкой литографии. Многоклеточных опухолевых сфероидов, образованных методом висячей капли, были вставлены и ограничены в прямоугольных камерах на устройство и поддерживается с непрерывной перфузии среды на одной стороне. Прямоугольной формы камер на устройство создано линейные градиенты в тканях. Флуоресцентные пятна были использованы для количественной йэлектронной изменчивости апоптоза в ткани. Опухоли на устройство обрабатывали флуоресцентным химиотерапевтического препарата доксорубицина, покадровой микроскопии был использован для мониторинга его диффузии в ткани, и эффективный коэффициент диффузии был оценен. Висячей капли метод позволил быстро формирование единого сфероидов из нескольких линий раковых клеток. Устройство включено роста сфероидов на срок до 3 дней. Клетки в непосредственной близости от протекающей среды было минимальным апоптоза и тех, недалеко от канала были более апоптоза, таким образом, точно имитируя регионах, прилегающих к опухоли кровеносных сосудов. Расчетная величина коэффициента диффузии доксорубицин согласился с ранее сообщал значение в человеческой рака молочной железы. Из-за проникновения и удержания препаратов в твердых опухолей влияет на их эффективность, мы считаем, что это устройство является важным инструментом в понимании поведения наркотиков, и разработка новых терапии рака.
Protocol
1. Устройство изготовления
Репликация микрофлюидных особенности в эластомерных материалов была основана на методике, описанной Даффи и др. 1.
- Mix эластомер (полидиметилсилоксана; PDMS) и отвердитель из комплекта кремнийорганический каучук (Dow Corning, Midland, MI) в соотношении 9:1 веса и залить мастер с образованием 4 мм толщины слоя. Дега, чтобы удалить пузырьки воздуха и вылечить смеси при 60 ° C в течение 5 часов. Пил вылечить PDMS из пресс-формы для получения штампа потока особенности на эластомера.
- Удар отверстия для входа и выхода использовании 1,5 мм биопсии удар (Miltex, Йорк, Пенсильвания), установленных на буровой прессы. Вытащить любой мусор.
- Подвергать особенностей стороне штамп и чистое предметное стекло для кислородной плазме в течение 8 минут в гравер плазме кислорода. Принесите обработанных поверхностей, контактирующих непосредственно с образованием связи между ними. Поддерживать сборки при 60 ° C на слайде теплее, по крайней мере, 5 часас укрепления связей.
- Подключите 0,032 "ID PTFE трубки (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) на входах и выходах с помощью интерфейса мужской Luer Lock разъемы прикреплены к колючей женщины Luer Lock разъемы (Qosina, Edgewood, Нью-Йорк).
- Настройка потока сборки с помощью запорных клапанов и Y-разъем (Upchurch научных, Oak Harbor, Вашингтон; рис. 1). Установите устройство на микроскопе. Прикрепите шприц с трубкой использованием 20G 1,5 "иглы (BD Bioscience, Роквилл, штат Мэриленд).
2. Формирование единого сфероидов
Сфероидов были сформированы методом висячей капли 2,3.
- Trypsinize клеток в стерильных капот культуре клеток.
- Центрифуга трипсинизированных клеток при 2000 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют в 6 мл свежей среды. Разбавьте раствор до желаемой конечной концентрации (табл. 1).
- Снимите крышку 48-луночный планшет и поместите его вниз головой в Sterilized капот. Циркуляр областях, соответствующих каждой скважине являются очевидными на обложке. Заполните каждую лунку планшета с 1 мл стерильной воды для поддержания влажности. Поместите 20 мкл капли разбавленного раствора ячейки в каждой круговой области использования микропипетки. Аккуратно перевернуть крышкой и поместите его над лунками, обеспечение того, чтобы капли не прикасаться к краям скважины.
- Инкубируйте а пластины при температуре 37 ° C в течение определенного количества дней (табл. 1). Сфероида будет формироваться в каждой висячей капли.
3. Введение сфероидов в устройство
Обратитесь к рисунку 1 и таблице 2 для этого раздела.
- Стерилизовать устройство промывки с 70% этанола вводят через потока на входе. Впоследствии, на одном уровне с PBS следуют HEPES буферной среде клеточной культуры. Оставьте F среду шприц S прикреплены к трубке.
- Ничья 2-3 сфероидов в шприц P S, нажмите шприц для удаления пузырьков воздуха, иприкрепляются к упаковке входе в устройство.
- Открыть впускной клапан V Pin и близких Fin V. Открыть выпускной клапан V Pout и близких Fout V. Держите упаковки шприцев вертикальные с иглы направлен вниз; наблюдать, как сфероидов оседают на дно шприца в Luer соединением замок иглы. Надавите на поршень на упаковке шприц и часы сфероидов ввести трубку и впадают в устройстве. Потому что только упаковка выпускной клапан открыт, сфероид войдет в камере устройства и храниться сообщения на спине (рис. 2).
- Закрыть впускной клапан V Pin и выпускной клапан V Pout. Установите F S шприц на шприц насоса. Откройте клапан V Fin и клапан V Fout. Поток среды в устройстве на 3 мкл / мин.
4. Введение апоптоза Обнаружение агента (CaspGLOW)
После упаковки камер с сфероидов, позволяющие равновесия для ир до 24 часов, чтобы установить питательных градиенты и микросреды, до введения апоптоза обнаружения или терапевтических агентов. Поскольку ткани в камере находятся в контакте с непроницаемой стены от верха и низа, нет никаких питательных градиенты по толщине (0,15 мм) ткани. После 24 часов инкубации, все клеточные слои по толщине ткани, следовательно, эквивалентны, и только неоднородности в направлении от потока канала.
- Отключите V Fin, остановить шприцевой насос, удалить F шприц S от насоса и заменить его с помощью шприца со средним уровнем содержащий 0,25 мкл / мл CaspGLOW Красной активность каспазы-3 маркера (красный-DEVD-FMK; BioVision, Mountain View, CA).
- Вручную очистить 0,7 мл этого раствора через устройство для обеспечения перемещения старше среды. Установите шприц на насос, перезапустить поток, и открытое V фин. В течение 5-8 часов, апоптоз обнаружения агента проникает тОн ткани и флуоресцирует ярче в апоптозе регионов. Апоптоз обнаружения агента на этом концентрация поддерживается во всех последующих решениях потока в устройство.
Примечание:
- Ткань неоднородность может быть подтверждена путем получения линейных профилей интенсивности флуоресценции, как описано в разделе 6. Профили должны показать пространственные градиенты в апоптозе, подтверждающие, что ткань неоднородна по отношению к жизнеспособности клеток.
- CaspGLOW Зеленый активность каспазы-3 маркера (флуоресцеин-DEVD-FMK; BioVision) также может быть использован для обнаружения апоптоза. Этот маркер содержит зеленый флуоресцеина флуорофора вместо красной родамина флуорофора.
5. Введение терапевтических агентов
- Следуйте инструкциям в шагах 4.1-4.2 ввести 10 мкМ доксорубицина гидрохлорид (Dox, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), содержащие апоптоза обнаружения агента.
- Продолжить поток therapeУтик решение агент в течение фиксированного периода времени. Запорный вентиль V Fin и выключить шприцевой насос. Заменить лечения шприц с новым шприцем среде, содержащей апоптоза обнаружения агента. Разрешить приток свежего среде в течение 24 -36 часов при непрерывном мониторинге ткани под микроскопом.
6. Замедленной микроскопии и оценивания коэффициентов температуропроводности наркотиков
Для получения чистых данные флуоресценции, приобретают все изображения при фокусировке микроскопа на нижних слоев ткани. Потому что нет никаких питательных градиенты в вертикальном направлении (см. раздел 4), нижний слои клеток хорошо представителей всех других слоев выше.
- Весь процесс приобретения были автоматизированы с помощью пользовательского сценария в IPLab (BD Bioscience, Роквилл, штат Мэриленд). Приобретать проходящем свете и флуоресценции изображений упакованы сфероида на 10-кратным увеличением каждые 30 минут (рис. 3А). Обретенияэлектронной изображение фоновой флуоресценции до введения Dox. Чтобы приспособить для большой размер камеры (1000 мкм х 300 мкм), приобретение двух смежных изображений и плитку их вместе 4.
- Для математической оценки коэффициентов диффузии наркотиков, первым шагом является получение усредненных линейных профилей интенсивности флуоресценции с помощью Dox ImageJ. Выбор прямоугольной области интереса (ROI) охватывает ткани в камере. Используйте команду участок профиля, чтобы создать профиль средней интенсивности в зависимости от расстояния от потока канала. Повторять до 3 различные моменты времени.
- Получить изображение фоновой флуоресценции до введения Dox для измерения автофлуоресценции из ткани. Вычтите средней интенсивности флуоресценции фон из полученных профилей интенсивности и нормализовать каждый профиль, соответствующий максимальной интенсивности для получения
(X, T) (рис. 3B). - Следующий шаг заключается в оценке эффективного коэффициента диффузии D от Dox в опухолевой ткани. Dox диффузии может быть представлена следующим уравнением 5
где ERFC является дополнительной функцией ошибок, х расстояние в ткани из канала, и т время после введения Dox (см. рис. 3). Используйте следующие итерационная схема в каждый момент времени считается:- Угадайте значение D
- Рассчитать правой стороны уравнения в каждой точке х
- Вычислить сумму квадратов ошибок (остаточной) между двумя сторонами
- Изменить D чтобы свести к минимуму остаточные
- Средняя оптимальные значения D, полученные на каждый момент времени оценить средний эффективный коэффициент диффузии Dox в ткани.
(X, T) (рис. 3B). 
7. Представитель Результаты:
<р = класса "jove_content"> микрофлюидных устройств при условии, 1 мм х 0,3 мм х 0,15 мм оптически доступными камерами культурой для выращивания трехмерных опухолевой ткани. Многоклеточных сфероидов опухоли были доставлены в этих камерах и были сохранены два фильтра сообщений на спине. Висячей капли метод позволил быстрого формирования сфероидов соответствует размеру и форме от нескольких клеточных линий. Сфероидов были успешно выращивают на устройство на срок до 3 дней. Рост в камерах было связано с воспроизводимыми изменения микросреды в сфероидов. Апоптоз произошел менее в клетках, в непосредственной близости от канала потока и более глубже в ткани. Устройство было использовано для оценки коэффициента диффузии доксорубицина в опухолевой ткани. Полученное значение 8,75 х 10 -7 см 2 с -1 согласен со значением 9,1 х 10 -7 см 2 с -1 сообщалось ранее 6 в человеческий рак молочной железы.| Клеточная линия | Требуемые концентрации клеток | Инкубационный время |
| LS174T | 300 клеток / мкл | 2-3 дней |
| T47D | 750 клеток / мкл | 3-4 дней |
| MDA-MB-231 | 150 клеток / мкл | 5-6 дней |
Таблица 1. Параметры для подвешивания сфероидов Выпадение
| Часть | Описание |
| S F | Поток Шприц |
| S P | Упаковка шприцев |
| В Fin | Клапан входе |
| V Pin | Упаковка впускного клапана |
| В Fout | Клапан Outlet |
| В Pout | Упаковка выпускной клапан |
Таблица 2. Шприцы и клапаны потока в установке
Рисунок 1 Схема потока установки V и V Fin Fout. Потока на входе и выходе клапана, V и V Pin Pout: Упаковка впускных и выпускных клапанов, S F и S P: Flow и упаковки шприцев. Упаковки шприцев и упаковки впускной и выпускной клапаны используются, когда сфероид прилетел в камере. Шприц потока и впускные и выпускные клапаны используются для текучей среды в дальнейшем.
Рисунок 2. Схема сфероида попали в камеру на устройстве. Сфероида течет в камеру на устройстве и их два фильтра позTS в задней части камеры.
Рисунок 3. Доксорубицин диффузии в ткани опухоли на устройстве. А. Объединенный проходящем свете и красного флуоресцентного изображения тканей, с указанием расположения и концентрации доксорубицина (в красном). Шкала бар представляет 250 мкм. B. нормализованной линейного профиля интенсивности флуоресценции от доксорубицина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сосудистой В опухолей является редким и плохо разработанные 7,8. Есть регионы, расположенные далеко (> 100 мкм) из кровеносных сосудов, которые являются недоступными для питательных веществ и лекарств, поставляемых хотя сосудистой 9. В результате гетерогенной микроокружения вносит свой вклад в ограниченную эффективность многих химиотерапевтических 10. Микрофлюидных устройство, разработанное здесь воссоздает гетерогенных микроокружения опухоли характеризуются разрастаются, покоя и апоптоз или некроз клеток в пробирке. Клетки в непосредственной близости от канала являются жизнеспособными, но диффузионные ограничения приводят к недостаточно питательно апоптоза областях, далеких от канала. Проточного канала представляет собой кровеносных сосудов и сфероида представляет собой небольшую область в опухоли, прилегающей к кровеносных сосудов.
Представляя сфероидов в устройство, убедитесь, что ударил входное отверстие чистым и свободным от мусора, потому что любое препятствие к потоку тканиприведет к невозможности заполнить камеру, или сломанный сфероида. Упаковка шприца управляется вручную в процессе внедрения сфероидов. Скорость потока должна поддерживаться как можно более низкой, чтобы избежать случайного нажатия сфероида через сообщения в задней части камеры. Как и все микрофлюидных устройств, некоторые меры должны быть приняты, чтобы избежать пузырей в системе, особенно при переключении шприцы. Резка небольшой кусок трубы каждый раз, когда шприц включается поможет избежать пузырей.
Изменения в устройстве, что позволяет использовать несколько камер и несколько процедур в одном эксперименте на постоянной основе. Мы считаем, что эти устройства могут быть использованы для понимания поведения текущей терапии рака в солидных опухолях. Они также могут быть использованы как легко построить лекарственного скрининг платформ для разработки новых методов лечения рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грант № 1R01CA120825-01A1, Совместного биомедицинских исследований (CBR) программа в Университете штата Массачусетс Амхерст, а также стипендии для Айзенберг Bhushan J. Toley. Мы выражаем глубокую признательность ценный вклад Джеймс Шафер, видеооператор, рассказчик, и редактор этого видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Miltex biopsy punch | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5 mm |
| PTFE tubing | Cole-Parmer | EW-06417-31 | 0.032" ID |
| Male luer lock connector | Qosina | 65111 | |
| Barbed female luer lock connector | Qosina | 11556 | |
| Shut-off valve | Idex Health and Science | P-721 | |
| Y-connector | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1.5" needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| CaspGLOW Fluorescein | Biovision Inc. | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision Inc. | K193-25 | |
| Doxorubicin Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Human Colon Carcinoma cell line |
| T47D | ATCC | HTB-133 | Human Ductal Carcinoma cell line |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Human Mammary Adenocarcinoma cell line |
References
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro. Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).
- Walsh, C. L. A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics. Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).
- Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. A mathematical model of drug transport in human breast cancer. Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).
- Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions. Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).
- Brown, J. M., Giaccia, A. J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
