Summary
نقدم الإجراء لتصنيع وتشغيل جهاز ميكروفلويديك الذي يجسد microenvironments ورم غير متجانسة
Abstract
قمنا بتطوير الجهاز ميكروفلويديك الذي يحاكي التسليم وإزالة النظامية من الأدوية إلى الأنسجة ثلاثي الأبعاد غير متجانسة السرطانية في المختبر. العناصر الغذائية التي تقدمها الأوعية الدموية تفشل في الوصول إلى جميع أجزاء من الأورام، مما أدى إلى microenvironments غير متجانسة تتكون من أنواع الخلايا قابلة للحياة، هادئة ونخرية. عقاقير مضادة للسرطان كثيرة لا تخترق بشكل فعال وعلاج جميع أنواع الخلايا وبسبب هذا التباين. Monolayers الخلايا السرطانية لا تقليد هذا التباين، مما يجعل من الصعب لاختبار عقاقير مضادة للسرطان مع نموذج مناسب في المختبر. ملفقة أجهزتنا ميكروفلويديك من PDMS باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة. أدرجت الأجسام الشبه الكروية الورم متعددة الخلايا، والتي شكلتها طريقة قطرة شنقا، ومقيدة إلى غرف مستطيلة على الجهاز والحفاظ على التروية المتوسطة مع المستمر على جانب واحد. إنشاء شكل مستطيل الغرف على الجهاز التدرجات الخطية داخل الأنسجة. واستخدمت البقع الفلورية لتحديد التقلب ه في موت الخلايا المبرمج داخل الأنسجة. تم علاج الأورام على الجهاز مع الفلورسنت تم استخدام العلاج الكيميائي المخدرات دوكسوروبيسين، الوقت الفاصل بين المجهري لرصد انتشارها في الأنسجة، وقدر معامل الانتشار الفعال. يسمح أسلوب قطرة شنقا سرعة تشكيل الأجسام الشبه الكروية موحدة من عدة خطوط الخلايا السرطانية. تمكين الجهاز نمو الأجسام الشبه الكروية لمدة تصل إلى 3 أيام. وكانت الخلايا التي تتدفق على مقربة من الحد الأدنى والمتوسط أفكارك بعيدا عن تلك القناة كانت أكثر أفكارك، وبالتالي محاكاة بدقة المناطق المتاخمة للأورام في الأوعية الدموية. وافق القيمة المقدرة للدوكسوروبيسين معامل انتشار بقيمة عنها سابقا في سرطان الثدي البشرية. لأن الاختراق والاحتفاظ المخدرات في الأورام الصلبة يؤثر فعاليتها، ونحن نعتقد أن هذا الجهاز هو أداة هامة في فهم سلوك المخدرات، وتطوير علاجات جديدة للسرطان.
Protocol
1. جهاز التصنيع
واستند تكرار الميزات ميكروفلويديك في المواد المرنة على طريقة وصفها دافي وآخرون .. 1
- الاستومر مزيج (polydimethylsiloxane؛ PDMS) وكيل علاج من سيليكون إلاستومر كيت (داو كورنينج وميدلاند، MI) في نسبة الوزن وأكثر من صب 09:01 الرئيسي لتشكيل طبقة سميكة 4 مم. ديغا لإزالة فقاعات الهواء وعلاج الخليط في C ° 60 لمدة 5 ساعات. قشر الشفاء من PDMS العفن للحصول على ختم من الميزات تدفق على المطاط الصناعي.
- شنت الثقوب لكمة لمداخل ومنافذ باستخدام 1.5 مم خزعة لكمة (Miltex، نيويورك، PA) على الصحافة الحفر. سحب أي حطام.
- إخضاع الجانب ملامح الطابع وشريحة زجاجية نظيفة لالأوكسجين البلازما لمدة 8 دقائق في الأكسجين مطبوع البلازما. جعل الأسطح المعالجة في الاتصال فورا لتشكيل رابطة بينهما. الحفاظ على الجمعية العامة في C ° 60 على الأكثر دفئا الشريحة لا يقل عن 5 ساعةق لتعزيز السندات.
- الاتصال 0،032 "أنابيب PTFE ID (كول Parmer، فيرنون هيلز، IL) إلى مداخل ومنافذ باستخدام واجهة من قفل الأنبوب ذكر الموصلات تعلق على الإناث الشائكة موصلات قفل الأنبوب (Qosina، إيدجوود، NY).
- انشاء الجمعية تدفق باستخدام صمامات اغلاق وموصل Y-(أبتشيرتش العلمية، اوك هاربور، WA، الشكل 1). تركيب جهاز إلى المجهر. إرفاق الحقن باستخدام أنابيب ل20G 1.5 "الإبر (BD العلوم البيولوجية، روكفيل، MD).
2. تشكيل الأجسام الشبه الكروية الموحدة
وتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من خلال طريقة قطرة شنقا 2،3.
- يعرض للتريبسين الخلايا تحت غطاء الخلية الثقافة العقيمة.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا trypsinized في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend في المتوسط مل 6 الطازجة. تخفيف محلول المخزون إلى تركيز النهائي المطلوب (الجدول 1).
- إزالة الغطاء من 48 لوحة جيدا ووضعه رأسا على عقب في الظريفrilized غطاء محرك السيارة. مناطق دائرية المقابلة لكل جيدا واضحة على الغلاف. ملء كل بئر من لوحة مع 1 مل من الماء المعقم للحفاظ على الرطوبة. وضع قطرة 20 ميكرولتر من الحل الخلية المخففة في كل منطقة دائرية باستخدام micropipette. عكس بعناية غطاء ووضعه على لوحة جيدا، وضمان أن لا تلمس قطرات حواف الآبار.
- احتضان لوحة جيدا في C ° 37 لعدد محدد من الأيام (الجدول 1). وسوف تشكل كروي في كل قطرة شنقا.
3. إدخال الأجسام الشبه الكروية في جهاز
الرجوع إلى الشكل 1 والجدول 2 لهذا القسم.
- تعقيم الجهاز عن طريق التنظيف مع الايثانول 70٪ من خلال عرض مدخل التدفق. وبعد ذلك، طرد مع PBS تليها HEPES مخزنة خلية ثقافة المتوسط. ترك الحقنة F S المتوسطة تعلق على الأنابيب.
- رسم 2-3 الأجسام الشبه الكروية في حقنة P S، اضغط حقنة لإزالة فقاعات الهواء، ونعلق على مدخل التعبئة للجهاز.
- فتح صمام مدخل V دبوس وإغلاق مؤشرات مالية V. فتح منفذ العبوس V صمام إغلاق وفوت V. عقد حقنة التعبئة الرأسية مع الإبرة نحو الانخفاض؛ مشاهدة الأجسام الشبه الكروية كما تترسب في القاع من المحقنة إلى الأنبوب الموصل للقفل الإبرة. دفع المكبس على حقنة التعبئة والأجسام الشبه الكروية ووتش إدخال الأنبوب وتصب في الجهاز. فقط لأن صمام مأخذ التعبئة مفتوحة، وسوف كروي دخول غرفة الجهاز ويتم الاحتفاظ من قبل المشاركات في الجزء الخلفي (الشكل 2).
- إغلاق مدخل صمام V دبوس ومنفذ العبوس V صمام. تحميل F S الحقنة على مضخة الحقنة. فتح صمام صمام V مؤشرات مالية وفوت V. تدفق المتوسطة في الجهاز في 3 ميكرولتر / دقيقة.
4. إدخال عامل موت الخلايا المبرمج الكشف عن (CaspGLOW)
بعد التعبئة غرف مع الأجسام الشبه الكروية، والسماح للموازنة شف إلى 24 ساعة لإنشاء تدرجات المغذيات وmicroenvironments، قبل تقديم كشف الخلايا أو العوامل العلاجية. لأن الأنسجة في غرف على اتصال مع الجدران التي لا يمكن اختراقها من أعلى وأسفل، لا توجد التدرجات المغذيات على طول سمك (0.15mm) من الأنسجة. بعد 24 ساعة من الحضانة، وجميع طبقات الخلايا على طول سمك الأنسجة وبالتالي تعادل عدم التجانس الوحيد هو في اتجاه بعيدا عن قناة التدفق.
- اغلاق مؤشرات مالية V، ووقف ضخ حقنة، حقنة إزالة F S من المضخة واستبدالها حقنة وجود المتوسطة تحتوي على 0.25 ميكروليتر / مل من CaspGLOW الأحمر بالموقع كاسباس-3 علامة (الحمراء DEVD-FMK؛ Biovision، ماونتن فيو، CA).
- مسح يدويا 0،7 مل من هذا الحل من خلال الجهاز لضمان تشريد أقدم المتوسط. تحميل الحقنة على مضخة، أعد تشغيل التدفق، ومؤشرات مالية مفتوحة V. على مدى فترة من 5-8 ساعات، وموت الخلايا المبرمج كشف وكيل ينشر في رانه نسيج وfluoresces أكثر إشراقا في مناطق أفكارك. ويحتفظ وكيل موت الخلايا المبرمج في الكشف عن هذا التركيز في كل الحلول تدفق اللاحقة في الجهاز.
ملاحظة:
- ويمكن التأكد من عدم التجانس الأنسجة عن طريق الحصول على ملفات تعريف كثافة خطية من مضان كما هو موضح في القسم 6. يجب أن تظهر ملامح التدرجات المكانية في موت الخلايا المبرمج، مؤكدا أن الأنسجة غير المتجانسة فيما يتعلق بقاء الخلية.
- CaspGLOW الخضراء بالموقع كاسباس-3 علامة (فلوريسئين DEVD--FMK؛ Biovision) ويمكن أيضا أن تستخدم لكشف الخلايا. هذه العلامة يحتوي على فلوريسئين fluorophore الأخضر بدلا من الأحمر رودامين fluorophore.
5. إدخال عامل علاجي
- اتبع الإجراء في الخطوات 4،1-4،2 لإنتاج 10 هيدروكلوريد دوكسوروبيسين ميكرومتر (دوكس؛ سيغما الدريخ، سانت لويس، MO) تحتوي على كشف وكيل موت الخلايا المبرمج.
- تواصل تدفق therapeUTIC حل كيلا لفترة محددة من الزمن. اغلاق صمام V مؤشرات مالية وإيقاف المضخة حقنة. استبدال المحاقن العلاج مع حقنة تحتوي على موت الخلايا المبرمج المتوسطة الطازجة كشف وكيل. تسمح تدفق المتوسطة الطازجة لمدة 24 -36 ساعة في حين رصد مستمر النسيج تحت المجهر.
6. الوقت الفاصل بين المجهري وتقدير معاملات انتشارية المخدرات
للحصول على البيانات مضان أنظف، والحصول على جميع الصور من خلال التركيز المجهر على الطبقات السفلي من الأنسجة. لأنه لا توجد التدرجات المغذيات في الاتجاه العمودي (انظر القسم 4)، وطبقات السفلي من الخلايا ممثلي جيدة من جميع الطبقات الأخرى أعلاه.
- وعملية الاستحواذ الآلي كامل باستخدام برنامج نصي مخصص في IPLab (BD العلوم البيولوجية، روكفيل، MD). الحصول على الصور المنقولة الخفيفة ومضان من كروي معبأة على التكبير 10x كل 30 دقيقة (الشكل 3A). Acquirه صورة من مضان الخلفية قبل إدخال دوكس. لاستيعاب الحجم الكبير لللغرفة (1000 × 300 ميكرومتر ميكرومتر)، والحصول على صورتين المجاورة والبلاط معا 4.
- لتقدير معاملات رياضية انتشارية المخدرات، فإن الخطوة الأولى هي لتوليد متوسط كثافة التشكيلات الخطية من مضان دوكس باستخدام يماغيج. تحديد منطقة مستطيلة ذات الاهتمام (ROI) تشمل الأنسجة في الغرفة. استخدم الأمر مؤامرة الشخصي لإنشاء ملف تعريف من شدة المتوسط بوصفها وظيفة من المسافة من قناة التدفق. كرر لمدة تصل إلى 3 نقاط زمنية مختلفة.
- الحصول على صورة خلفية مضان قبل إدخال دوكس لقياس تألق ذاتي من الأنسجة. طرح مضان الخلفية متوسط كثافة من كثافة التشكيلات التي تم الحصول عليها وتطبيع كل من شدة الشخصي الحد الأقصى للحصول على المقابلة
(خ، ر) (الشكل 3B). - الخطوة التالية هي تقييم فعالية معامل الانتشار D من دوكس داخل أنسجة الورم. يمكن أن تكون ممثلة من قبل دوكس نشر المعادلة 5 التالية
حيث erfc هي وظيفة مكملة الخطأ، x هو المسافة في الأنسجة من القناة، وحان الوقت بعد ر إدخال دوكس (راجع الشكل رقم 3). استخدم ما يلي مخطط تكراري في كل نقطة تعتبر الوقت:- تخمين قيمة لD
- حساب الجانب الأيمن من المعادلة في كل مكان X
- حساب مجموع الأخطاء مربع (المتبقية) بين الجانبين
- تعديل D لتقليل المتبقية
- متوسط القيم الأمثل للD تم الحصول عليها في كل نقطة من الوقت لتقدير متوسط معامل الانتشار الفعال للدوكس في الأنسجة.
(خ، ر) (الشكل 3B). 
7. ممثل النتائج:
<ف الطبقة = "jove_content"> الأجهزة ميكروفلويديك تقديم 1MM X 0.3mm 0.15mm X بصريا غرف ثقافة الوصول إليها لنمو أنسجة الورم ثلاثي الأبعاد. تم نقل الأجسام الشبه الكروية متعددة الخلايا السرطانية في هذه الدوائر وكانت تحتفظ بها وظيفتين مرشح في الخلف. يسمح أسلوب قطرة شنقا سرعة تشكيل الأجسام الشبه الكروية من حجم ثابت وشكل من عدة خطوط الخلايا. كانت تزرع بنجاح الأجسام الشبه الكروية على الجهاز لمدة تصل إلى 3 أيام. ارتبط النمو في غرف مع تعديل استنساخه من microenvironments داخل الأجسام الشبه الكروية. حدث موت الخلايا المبرمج في الخلايا أقل على مقربة من القناة وتدفق أعلى أعمق في الأنسجة. تم استخدام جهاز لتقدير معامل انتشار دوكسوروبيسين في أنسجة الورم. القيمة التي تم الحصول عليها من 8.75 X 10 -7 -1 سم S 2 تتفق مع قيمة قدرها 9.1 X 10 -7 سم 2 ث -1 عنها سابقا 6 في سرطان الثدي البشرية.| خلية الخط | مطلوب خلية تركيز | حضانة الزمن |
| LS174T | 300 خلية / ميكرولتر | 2-3 أيام |
| T47D | 750 خلية / ميكرولتر | 3-4 أيام |
| MDA-MB-231 | 150 خلية / ميكرولتر | 5-6 أيام |
الجدول 1. معلمات لإسقاط الأجسام الشبه الكروية المعلقة
| جزء | وصف |
| S F | تدفق الحقنة |
| S P | التعبئة الحقنة |
| V مؤشرات مالية | تدفق مدخل صمام |
| V الدبوس | التعبئة صمام مدخل |
| V فوت | تدفق صمام المخرج |
| V العبوس | التعبئة صمام المخرج |
الجدول 2. صمامات الحقن وتدفق في الإعداد
الشكل 1 تخطيطي للمؤشرات مالية الإعداد V V وتدفق فوت: مدخل التدفق وصمامات منفذ؛ V V دبوس والعبوس: مدخل تغليف وصمامات منفذ؛ S F S وP: تدفق الحقن والتعبئة. وتستخدم الحقنة التعبئة والتغليف مدخل ومخرج الصمامات عند جوا كروي في الغرفة. وتستخدم الحقنة تدفق وتدفق وصمامات مدخل مخرج لتدفق المتوسطة في وقت لاحق.
الشكل 2. التخطيطي لكروي المحاصرين في غرفة على الجهاز. وتدفقت A كروي في غرفة على الجهاز ويتم حظرها بواسطة نقاط البيع تصفية 2TS في الجزء الخلفي من الغرفة.
الشكل 3. دوكسوروبيسين نشرها في أنسجة الورم على الجهاز. مدموجة A. تنتقل الصورة الفلورية ضوء أحمر والنسيج، والتي تبين موقع وتركيز دوكسوروبيسين (باللون الأحمر). شريط النطاق يمثل 250 ميكرون. B. تطبيع الملف الشخصي كثافة مضان خطية من دوكسوروبيسين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأوعية الدموية في الأورام متناثر وضعت سوء 7،8. هناك مناطق تقع على مسافة بعيدة (> 100 ميكرون) من الأوعية الدموية التي لا يمكن الوصول إليها لتوفير المواد الغذائية والأدوية على الرغم من ال 9 الأوعية الدموية. والمكروية غير متجانسة مما أدى يسهم في فعالية محدودة من مبحث المعالجة الكيميائية كثيرة 10. الجهاز ميكروفلويديك المتقدمة بإعادة هنا لالمكروية ورم غير متجانسة تتميز المتكاثرة، الخلايا هادئة وأفكارك أو نخرية، في المختبر. الخلايا على مقربة من القناة قابلة للبقاء، ولكن القيود تؤدي إلى نشر أفكارك المناطق ناقصة من الناحية التغذوية بعيدا عن القناة. قناة تدفق يمثل الأوعية الدموية وكروي يمثل منطقة صغيرة داخل الورم المجاورة لأحد الأوعية الدموية.
مع إدخال الأجسام الشبه الكروية في الجهاز، تأكد من أن ثقب مدخل لكمات نظيفة وخالية من الحطام، لأن أي عرقلة لتدفق الأنسجةسوف يؤدي إلى الفشل في ملء الغرفة، أو كسر كروي. ويتم تشغيل الحقنة التعبئة يدويا أثناء عملية إدخال الأجسام الشبه الكروية. يجب المحافظة على معدل التدفق عند أدنى مستوى ممكن لتجنب دفع كروي من خلال المشاركات في الجزء الخلفي من الغرفة. كما هو الحال مع جميع أجهزة ميكروفلويديك، يجب اتخاذ تدابير معينة لتجنب فقاعات في النظام، وخصوصا عندما تحول الحقن. قطع قطعة صغيرة من الأنبوب في كل مرة يتم فيها تشغيل حقنة سوف يساعد على تجنب الفقاعات.
تعديلات على الجهاز للسماح باستخدام دوائر متعددة ومعالجات متعددة في تجربة واحدة مستمرة. نعتقد أنه يمكن استخدام هذه الأجهزة لفهم سلوك علاجات السرطان الحالية في الأورام الصلبة. ويمكن أيضا أن تستخدم وسهلة لبناء منصات فحص المخدرات لتطوير علاجات جديدة للسرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح # 1R01CA120825-01A1، والأبحاث التعاونية الطبية الحيوية (CBR) برنامج في جامعة ماساتشوستس في امهرست، والمنح الدراسية لIsenberg بوشان J. Toley. نحن نعترف بامتنان المساهمة القيمة من شافر جيمس، مصور فيديو، الراوي، ورئيس تحرير هذا الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Miltex biopsy punch | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5 mm |
| PTFE tubing | Cole-Parmer | EW-06417-31 | 0.032" ID |
| Male luer lock connector | Qosina | 65111 | |
| Barbed female luer lock connector | Qosina | 11556 | |
| Shut-off valve | Idex Health and Science | P-721 | |
| Y-connector | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1.5" needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| CaspGLOW Fluorescein | Biovision Inc. | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision Inc. | K193-25 | |
| Doxorubicin Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Human Colon Carcinoma cell line |
| T47D | ATCC | HTB-133 | Human Ductal Carcinoma cell line |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Human Mammary Adenocarcinoma cell line |
References
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro. Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).
- Walsh, C. L. A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics. Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).
- Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. A mathematical model of drug transport in human breast cancer. Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).
- Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions. Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).
- Brown, J. M., Giaccia, A. J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
