私たちは、異種腫瘍微小環境を再現し、マイクロ流体デバイスの作製及び操作のための手順を紹介 in vitroで。腫瘍組織内アポトーシスの変動を評価した蛍光染色し、腫瘍組織への化学療法薬ドキソルビシンの有効拡散係数を用いて定量した。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
我々は、in vitroでの異種3次元腫瘍組織への薬物の送達及び全身クリアランスを模倣したマイクロ流体デバイスを開発しました。血管系で配信栄養素は、実行可能な静止および壊死細胞の種類により構成される異種微小環境を生み出して、腫瘍のすべての部分に到達しない。多くの抗がん剤は効果的に細胞のため、この異質のすべてのタイプを貫通し、治療に失敗する。がん細胞の単層は、それが困難なin vitroモデルを適当に抗がん剤をテストすること、この異質性を模倣することはできません。当社のマイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィーを用いたPDMSから製造された。ハンギングドロップ法により形成された多細胞腫瘍スフェロイドは、挿入され、拘束装置の長方形のチャンバーに、片面に連続媒体の血流を維持した。デバイス上室の矩形形状は、組織内で線形グラデーションを作成しました。蛍光汚れは目を定量化するために使用された組織内のアポトーシスにおけるe変動。デバイス上の腫瘍が蛍光化学療法薬ドキソルビシンで処理した、タイムラプス顕微鏡組織への拡散を監視するために使用され、有効拡散係数を推定した。ハンギングドロップ法は、いくつかの癌細胞株からの均一なスフェロイドの迅速な形成を可能にした。デバイスは、最大3日間までスフェロイドの成長を可能にしました。媒体を流すの近傍の細胞がアポトーシスを起こしていた最低限、それらの遠い路からそれによって正確に血管に隣接する腫瘍内の領域を模倣し、より多くのアポトーシスであった。ドキソルビシンの拡散係数の推定値は、ヒト乳癌における以前に報告された値と一致していた。固形腫瘍における薬剤の浸透および保持は、その有効性に影響を与えるため、我々は、このデバイスは薬剤の挙動を理解し、新たながん治療薬を開発する上で重要なツールであると信じています。
プロトコル
1。デバイス製造
エラストマー材料のマイクロ流体の特徴のレプリケーションがダフィーらの方法に基づいていた。1
- ミックスエラストマー（ポリジメチルシロキサン、PDMS）および9:1の重量比でシリコーンエラストマーキット（ ダウコーニング 、ミッドランド、ミシガン州）から硬化剤と4ミリメートル厚い層を形成するために、マスターの上に注ぐ。ドガは、5時間60℃で気泡を除去し、混合物を硬化させた。ピールエラストマー上の流れの特徴のスタンプを取得するための金型からPDMSを硬化させた。
- 1.5ミリメートル生検パンチ（Miltex、ヨーク、ペンシルバニア州）を用いて、入口と出口のためのパンチ穴はドリルプレスに搭載された。ごみを取り出し。
- スタンプの機能側と酸素プラズマエッチャーで8分間酸素プラズマにきれいなガラススライドを施す。それらの間の結合を形成するためにすぐに接触して処理された表面を持参してください。少なくとも5時間ウォーマースライド上60°Cでアセンブリを維持の結合を強化するために、S。
- 有刺鉄線メスルアーロックコネクタ（Qosina、エッジウッド、ニューヨーク州）に取り付けられたオスルアーロックのインターフェースコネクタを使用して入口と出口に0.032 "ID PTFEチューブ（ コールパーマー 、ヴァーノンヒル....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
腫瘍内の血管系は、スパース行列で、病気7,8を開発しました 。血管系9にもかかわらず供給栄養素や薬にアクセスできない血管から遠い位置にある領域（>100μm）にあります。得られた不均一微小環境は、多くの化学療法剤10の限られた有効性に貢献しています。ここで開発したマイクロ流体デバイスは、in vitroで、静止し、アポトーシスまたはネクローシス細胞を増殖によって特徴付けられる異種腫瘍微小環境を再現しています。チャネルの近接性の細胞は生存可能であるが、拡散限界をはるかチャンネルから栄養欠乏地域アポトーシスを引き起こす。流路には血管を表し、回転楕円体は、血管に隣接する腫瘍内の小さな領域を表します。
デバイスにスフェロイドを紹介しながら、任意の障害物が組織の流れにあるため、パンチ入口孔を清潔にし、破片がないことを保証すること室を埋めるために失敗した、または壊れた回転楕円体になります。パッキングシリンジがスフェロイドを導入する過程で手動で操作される。流量は、チャンバーの背面に支柱を通してス.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
この作品は、厚生助成金総合研究所＃1R01CA120825-01A1、マサチューセッツ大学アマースト校での共同医学研究（CBR）のプログラム、BhushanをJ. Toley用アイゼン奨学金によってサポートされていました。私たちは感謝してジェームズ·シェーファー、ビデオ撮影、ナレーター、そしてこのビデオの編集者の貴重な貢献を承諾します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名称 | 会社 | カタログ番号 | 注釈 |
| シリコーンエラストマーキット | エルズワースの接着剤 | 184シルELASTキット | |
| Miltex生検パンチ | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5ミリメートル |
| PTFEチューブ | コールパーマー | EW-06417から31 | 0.032 "ID |
| オス型ルアーロックコネクタ | Qosina | 65111 | |
| とげの雌型ルアーロックコネクタ | Qosina | 11556 | |
| 遮断弁 | IDEX健康科学 | P-721 | |
| Yコネクタ | IDEX健康科学 | P-513 | |
| 20G 1.5 "針 | BD Bioscienc電子 | 305176 | |
| トリプシン-EDTA | インビトロジェン | 25300-054 | |
| HEPES | シグマ | H-4034 | |
| CaspGLOWフルオレセイン | バイオビジョン | K183-25 | |
| CaspGLOW赤 | バイオビジョン | K193-25 | |
| 塩酸ドキソルビシン | シグマ | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | ヒト結腸癌細胞株 |
| T47D | ATCC | HTB-133 | 人間の乳管癌細胞株 |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | ヒト乳腺腺癌細胞株 |
参考文献
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
