Summary
Wir präsentieren, das Verfahren für die Herstellung und den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die heterogene Tumor Mikroumgebungen nachbildet
Abstract
Wir haben eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die die Lieferung und die systemische Clearance von Medikamenten zur heterogenen dreidimensionalen Tumorgewebe in vitro imitiert entwickelt. Nährstoffen durch Vaskulatur geliefert fehlschlagen, alle Teile von Tumoren zu erreichen, was zu heterogenen Mikroumgebungen bestehend aus lebensfähigen, Ruhestrom und nekrotischen Zelltypen. Viele Krebsmedikamente nicht effektiv durchdringen und behandeln alle Arten von Zellen, weil dieser Heterogenität. Monoschichten von Krebszellen nicht nachzuahmen diese Heterogenität, was es schwierig macht Krebsmedikamente mit einem geeigneten in vitro-Modell zu testen. Unsere mikrofluidischen Bauteilen wurden aus PDMS hergestellt mit weichen Lithographie. Vielzelligen Tumorsphäroide, durch den hängenden Tropfen-Verfahren gebildet wurden eingesetzt und in rechteckige Kammern auf der Vorrichtung eingespannt und gehalten mit Endlosmediums Perfusion auf einer Seite. Die rechteckige Form der Kammern auf dem Gerät erstellt lineare Gradienten im Gewebe. Fluoreszenzfarbstoffe wurden verwendet, um th zu quantifizierene Variabilität Apoptose innerhalb Gewebe. Tumore auf der Vorrichtung wurden mit dem fluoreszierenden Chemotherapeutikum Doxorubicin, Zeitraffer-Mikroskopie wurde verwendet, um ihre Diffusion in Gewebe zu überwachen, und der effektive Diffusionskoeffizient wurde geschätzt behandelt. Die hängenden Tropfen Methode erlaubt schnelle Bildung einer einheitlichen Sphäroide aus mehreren Krebszelllinien. Das Gerät aktiviert Wachstum von Sphäroiden für bis zu 3 Tage. Cells in der Nähe des strömenden Mediums waren minimal apoptotischen und die weit aus dem Kanal waren apoptotische und damit exakt imitiert Regionen in Tumoren neben Blutgefäße. Der geschätzte Wert des Doxorubicin Diffusionskoeffizient vereinbarten mit einem zuvor gemeldeten Wert in menschlichen Brustkrebszellen. Da die Penetration und Retention von Drogen in soliden Tumoren wirkt sich auf ihre Wirksamkeit, glauben wir, dass dieses Gerät ein wichtiges Instrument zum Verständnis des Verhaltens von Drogen, und die Entwicklung neuer Krebstherapeutika ist.
Protocol
Ein. Vorrichtung Fabrication
Replikation von mikrofluidischen Merkmale in Elastomermaterialien wurde für das Verfahren von Duffy et al beschrieben ist. 1
- Mix Elastomer (Polydimethylsiloxan; PDMS) und Härter aus der Silikon-Elastomer Kit (Dow Corning, Midland, MI) in einem 9:1 Gewichtsverhältnis und übergießen Sie den Master mit einem 4 mm dicken Schicht bilden. Entgasen zur Entfernung von Luftblasen und aushärten der Mischung bei 60 ° C für 5 Stunden. Peel gehärteten PDMS aus der Form, um einen Stempel Strömungsrichtung Merkmale auf dem Elastomer zu erhalten.
- Stanzlöcher für Ein-und Auslässe mit einem 1,5 mm Biopsiestanze (Miltex, York, PA), die an einer Bohrmaschine. Ziehen Sie alle Fremdkörper.
- Thema Die Funktionen Seite des Stempels und einer sauberen Glasobjektträger einem Sauerstoffplasma für 8 Minuten in einem Sauerstoffplasma Radierer. Bringen der behandelten Flächen in Kontakt sofort, um eine Bindung zwischen ihnen auszubilden. Pflegen Sie die Montage bei 60 ° C auf einer Folie wärmer für mindestens 5 Stundens zur Stärkung der Bindung.
- Verbinden 0,032 "ID PTFE-Schlauch (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) zu den Einlässen und Auslässen über eine Schnittstelle des männlichen Luer-Lock-Anschlüsse angebracht Widerhaken weiblichen Luer-Lock Verbinder (Qosina, Edgewood, NY).
- Richten Sie die Fließmontage mit Absperrventilen und eine Y-Stecker (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Abbildung 1). Montieren Sie das Gerät mit dem Mikroskop. Bringen Spritzen Schlauch mit 20G 1,5 "Nadeln (BD Bioscience, Rockville, MD).
2. Bildung Uniform Spheroids
Sphäroide wurden von der hängenden Tropfen-Methode 2,3 gebildet.
- Trypsinieren Zellen unter einer sterilen Zellkultur Kapuze.
- Zentrifuge trypsinierten Zellen bei 2000 rpm für 5 Minuten und resuspendieren in 6 ml frisches Medium. Verdünnen der Stammlösung zu einer gewünschten Endkonzentration (Tabelle 1).
- Entfernen Sie den Deckel einer 48-Well-Platte und legen Sie sie kopfüber in die sterilized Kapuze. Circular entsprechenden Bereiche in jede Vertiefung sind auf dem Cover ersichtlich. Füllen Sie jede Vertiefung der Platte mit 1 ml sterilem Wasser Feuchtigkeit halten. Setzen Sie einen 20 ul Tropfen der verdünnten Zell-Lösung in jedem kreisförmigen Bereich mit einer Mikropipette. Sorgfältig invertieren Sie die Abdeckung und legen Sie es über den Well-Platte, so dass die Tropfen nicht berühren die Kanten der Brunnen.
- Inkubieren der Mikrotiterplatte bei 37 ° C für eine bestimmte Anzahl von Tagen (Tabelle 1). Ein Sphäroid wird in jedem hängenden Tropfen bilden.
3. Einführung der Sphäroide in Device
Siehe Abbildung 1 und Tabelle 2 für diesen Abschnitt Abbildung.
- Sterilisieren der Vorrichtung durch Spülen mit 70% Ethanol durch die Strömungseinlaß eingeführt. Anschließend bündig mit PBS gefolgt von HEPES gepufferte Zellkulturmedium. Lassen Sie das Medium Spritze S F an den Schläuchen.
- Zeichnen 2-3 Sphäroide in die Spritze S P, tippen Spritze, um Luftblasen zu entfernen, undBefestigen der Verpackung Einlaß der Vorrichtung.
- Offene Einlaßventil V Pin und enge V Fin. Geöffnete Auslassventil V Pout und enge V Fout. Halten Sie die Verpackung Spritze senkrecht mit der Nadel nach unten; zusehen, wie Sphäroide auf den Boden der Spritze niederlassen in den Luer-Lock-Anschluss der Nadel. Drücken Sie den Kolben auf der Verpackung Spritze und Uhr Sphäroide geben Sie den Schlauch und fließen in das Gerät. Weil nur die Packung Auslaßventil offen ist, wird ein Sphäroid die Kammer eintreten der Vorrichtung und durch Stützen auf der Rückseite (Fig. 2) erhalten.
- Einlass schließen V Pin und Auslassventil V Pout. Montieren der Spritze S F auf einer Spritzenpumpe. Öffnen Sie das Ventil V Fin und Ventil V Fout. Fördermedium in das Gerät 3 ul / min.
4. Einleitung der Apoptose Erkennen Agent (CaspGLOW)
Nach dem Packen Kammern mit Sphäroide erlauben Äquilibrierung für up bis 24 Stunden, um Nährstoff Gradienten und Mikroumgebungen herzustellen, vor dem Einführen Apoptose Nachweisen oder Therapeutika. Da die Gewebe in den Kammern in Kontakt mit undurchdringlichen Mauern von oben und unten sind, gibt es keine Nährstoff Gradienten entlang der Dicke (0,15 mm) des Gewebes. Nach 24 Stunden Inkubation werden alle Zellschichten entlang der Dicke des Gewebes entspricht mithin und die einzige Heterogenität ist in einer Richtung weg von dem Strömungskanal.
- Abgeschaltet V Fin, stoppen Sie die Spritzenpumpe Spritze abnehmen S F von der Pumpe und ersetzen sie durch eine Spritze mit Medium mit 0,25 ul / ml CaspGLOW Red Aktive Caspase-3 Marker (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, CA).
- Manuell bündig 0,7 ml dieser Lösung durch die Vorrichtung, um eine Verschiebung der älteren Medium zu gewährleisten. Montieren Sie die Spritze an der Pumpe, starten Flow und offenen V Fin. Über einen Zeitraum von 5-8 Stunden, Erfassen der Apoptose Agenten diffundiert in tEr Gewebe und fluoresziert heller apoptotischen Regionen. Apoptosis Sprühmittel bei dieser Konzentration wird in allen weiteren Workflow-Lösungen in das Gerät erhalten.
Hinweis:
- Tissue Heterogenität kann durch den Erwerb lineare Intensitätsprofile der Fluoreszenz, wie in Abschnitt 6 beschrieben bestätigt werden. Die Profile sollten räumlichen Gradienten in der Apoptose zeigen, bestätigt, dass das Gewebe heterogen in Bezug auf die Lebensfähigkeit der Zellen ist.
- CaspGLOW Grün Aktiv Caspase-3 Marker (Fluorescein-DEVD-FMK, Biovision) kann auch verwendet werden, um die Apoptose zu detektieren. Dieser Marker enthält das grüne Fluorophor Fluorescein anstelle des roten Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin.
5. Einführung des therapeutischen Wirkstoffs
- Befolgen Sie die Anweisungen in den Schritten 4,1-4,2 bis 10 uM Doxorubicinhydrochlorid (Dox, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) einzuführen, die Apoptose Sprühmittel.
- Weiterhin Strömung des therapeUTIC Wirkstofflösung für eine feste Zeitspanne. Absperrventil V Fin und schalten Sie die Spritzenpumpe. Ersetzen der Behandlung Spritze mit einer Spritze, die frisches Medium Apoptose Nachweismittel. Erlauben Strömung von frischem Medium für 24 Stunden unter -36 kontinuierliches Überwachen des Gewebes unter dem Mikroskop.
6. Zeitraffer-Mikroskopie und Estimation of Drug Diffusivität Koeffizienten
Zum Erhalten saubersten Fluoreszenzdaten, alle Bilder zu erwerben durch Fokussieren des Mikroskops auf die unteren Schichten von Geweben. Da es keine Nährstoff-Gradienten in vertikaler Richtung (siehe Abschnitt 4), sind die unteren Schichten von Zellen gute Vertreter aller anderen Schichten über.
- Die gesamte Übernahme-Prozess automatisiert wurde mithilfe einer angepassten Skript in IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Erwerben Durchlicht und Fluoreszenz-Aufnahmen des verpackten Sphäroid bei 10facher Vergrößerung alle 30 Minuten (Abb. 3A). AcquirE ein Bild der Hintergrundfluoreszenz vor der Einführung Dox. Um nach der Größe der Kammer (x 1000 um 300 um) unterzubringen, zu erwerben zwei angrenzenden Bildern und überlappend, gemeinsam 4.
- Für mathematische Schätzung Medikament Diffusivität Koeffizienten, ist der erste Schritt, um gemittelte linearen Intensitätsprofile Dox Fluoreszenz unter Verwendung ImageJ erzeugen. Wähle einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI), das die Gewebe in der Kammer. Verwenden der Plot Befehl Profil, ein Profil der mittleren Intensitäten als eine Funktion des Abstandes von dem Strömungskanal zu erzeugen. Wiederholen Sie dies für bis zu 3 verschiedenen Zeitpunkten.
- Besorgen Sie sich eine Hintergrundfluoreszenz Bild vor Einführung Dox zur Autofluoreszenz aus dem Gewebe zu messen. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenzintensität aus den erhaltenen Intensitätsprofile und normalisieren jedes Profil durch die entsprechende maximale Intensität zu erhalten
(X, t) (Abb. 3B). - Der nächste Schritt ist, den effektiven Diffusionskoeffizienten D der Dox innerhalb Tumorgewebe auszuwerten. Dox Diffusion kann durch die folgende Gleichung 5 dargestellt werden
wobei die komplementäre erfc Fehlerfunktion ist, x Abstand in das Gewebe aus dem Kanal, und t die Zeit nach dem Einbringen Dox (s. Abbildung. 3). Verwenden Sie die folgenden iterativen Schema zu jedem Zeitpunkt in Betracht gezogen:- Ratet mal, einen Wert für D
- Berechnen rechten Seite der Gleichung an jedem Ort x
- Berechnen der Summe der quadrierten Fehler (Rest-) zwischen den zwei Seiten
- Ändern D den Rest-Minimierung
- Durchschnittlichen die optimalen Werte von D zu jedem Zeitpunkt erhalten, um die durchschnittliche effektive Diffusionskoeffizient Dox im Gewebe abzuschätzen.
(X, t) (Abb. 3B). 
7. Repräsentative Ergebnisse:
<p class = "jove_content"> Die Mikrofluidikeinheiten 1mm x 0.3mm x 0.15mm optisch zugänglichen Kultur Kammern für das Wachstum von dreidimensionalen Tumorgewebe. Vielzelligen Tumorsphäroide wurden in diesen Kammern geflogen und wurden durch zwei Filter Beiträge auf der Rückseite erhalten. Der hängende Tropfen Verfahren erlaubt schnelle Bildung von Sphäroiden konsistenter Größe und Form aus mehreren Zelllinien. Sphäroide wurden erfolgreich auf dem Gerät gewachsen für bis zu 3 Tage. Das Wachstum in den Kammern wurde mit einer reproduzierbaren Änderung Mikroumgebungen in Sphäroide verbunden. Apoptose in Zellen aufgetreten weniger in der Nähe des Strömungskanals und höheren tiefer in das Gewebe. Die Vorrichtung wurde verwendet, um den Diffusionskoeffizienten von Doxorubicin in Tumorgewebe zu schätzen. Der erhaltene Wert von 8,75 x 10 -7 cm 2 s -1 stimmt der Wert von 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 zuvor berichtet 6 in menschlichen Brustkrebszellen.| Cell Line | Erforderliche Zellkonzentration | Inkubationszeit |
| LS174T | 300 Zellen / ul | 2-3 Tage |
| T47D | 750 Zellen / ul | 3-4 Tage |
| MDA-MB-231 | 150 Zellen / ul | 5-6 Tage |
Tabelle 1. Parameter für hängenden Tropfen Spheroids
| Teil | Beschreibung |
| S F | Flow Spritze |
| S P | Verpackung Spritze |
| V Fin | Flow Einlassventil |
| V Pin | Verpackung Einlassventil |
| V Fout | Flow Auslassventil |
| V Pout | Verpackung Auslassventil |
Tabelle 2. Spritzen und Ventile in Flow-Setup
Abbildung 1 Schematische Darstellung des Flow Setup V Fin und V Fout:. Flow-Einlass-und Auslassventile, V Pin und V Pout: Verpackung Einlass-und Auslassventile, S F und S P: Flow und Verpackung Spritzen. Die Verpackung Spritze und Verpacken und Auslaßventile werden verwendet, wenn ein Sphäroid in die Kammer geflogen wird. Die Strömung Spritze und Strömungseinlaß und Auslaßventile werden verwendet, um Medium anschließend fließen.
Abbildung 2. Schema eines Sphäroids in einer Kammer auf der Vorrichtung gefangen. Ein Sphäroid in die Kammer auf der Vorrichtung durchströmt und durch zwei Filter blockiert posts an der Rückseite der Kammer.
Abbildung 3. Doxorubicin Diffusion in Tumorgewebe auf dem Gerät. A. Zusammengeführt Durchlicht und rot fluoreszierenden Bild des Gewebes, des Standorts und der Konzentration von Doxorubicin (in rot). Maßstab stellt 250 um. B. Normalized lineare Intensität Profil von Doxorubicin Fluoreszenz.
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Discussion
Das Gefäßsystem in Tumoren ist spärlich und schlecht entwickelten 7,8. Es gibt Regionen weit (> 100 um) aus den Blutgefäßen, die unzugänglich Nährstoffe und Medikamente obwohl das Gefäßsystem 9 zugeführt werden entfernt. Die resultierende heterogene Mikroumgebung trägt zur begrenzten Wirksamkeit vieler Chemotherapeutika 10. Die Mikrofluidvorrichtung hier entwickelten erschafft ein heterogenes Tumormikroumgebung durch proliferierende, ruhende und apoptotischen oder nekrotischen Zellen in vitro charakterisiert. Zellen in der Nähe des Kanals sind lebensfähig, aber Diffusionsbeschränkungen verursachen ernährungsphysiologisch mangelhaft apoptotischen Regionen weit aus dem Kanal. Der Strömungskanal für ein Blutgefäß und das Sphäroid eine kleine Region innerhalb eines Tumors benachbart einem Blutgefäß.
Während die Einführung Sphäroide in das Gerät sicherstellen, dass die gestanzten Einlassloch sauber und frei von Schmutz ist, weil jede Behinderung des Gewebes fließenführt zum Versagen führen, um die Kammer oder eine gebrochene Sphäroids zu füllen. Die Verpackung Spritze manuell während des Prozesses der Einführung Sphäroide betrieben. Die Fließgeschwindigkeit ist so gering wie möglich gehalten werden, um zu vermeiden, durch Drücken des Sphäroids den Pfosten an der Rückseite der Kammer. Wie bei allen Mikrofluidikvorrichtungen, müssen bestimmte Maßnahmen ergriffen werden, um Blasen in dem System zu vermeiden, insbesondere beim Umschalten Spritzen werden. Schneiden Sie ein kleines Stück Schlauch jedes Mal eine Spritze eingeschaltet vermeiden Blasen.
Änderungen am Gerät die Nutzung von mehreren Kammern und mehrere Behandlungen in einem einzigen Experiment ermöglichen, sind im Gange. Wir glauben, dass diese Vorrichtungen verwendet werden können, um das Verhalten des Stroms Krebstherapeutika in soliden Tumoren zu verstehen. Sie können auch als einfache verwendet werden, um Drogen-Screening-Plattformen zu bauen, um neue Krebstherapien zu entwickeln.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grant # 1R01CA120825-01A1, die Collaborative Biomedical Research (CBR) Program an der University of Massachusetts Amherst und der Isenberg Stipendium für Bhushan J. Toley unterstützt. Wir danken den wertvollen Beitrag von James Schafer, der Videofilmer, Erzähler und Herausgeber dieses Videos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Miltex biopsy punch | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5 mm |
| PTFE tubing | Cole-Parmer | EW-06417-31 | 0.032" ID |
| Male luer lock connector | Qosina | 65111 | |
| Barbed female luer lock connector | Qosina | 11556 | |
| Shut-off valve | Idex Health and Science | P-721 | |
| Y-connector | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1.5" needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| CaspGLOW Fluorescein | Biovision Inc. | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision Inc. | K193-25 | |
| Doxorubicin Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Human Colon Carcinoma cell line |
| T47D | ATCC | HTB-133 | Human Ductal Carcinoma cell line |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Human Mammary Adenocarcinoma cell line |
References
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
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- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
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- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).
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