Summary
Saponin - permeabilized respirometric oxidative phosphorylation विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में फाइबर की तैयारी mitochondrial समारोह के एकीकृत मूल्यांकन प्रदान करता है. शारीरिक और रोग राज्यों में mitochondrial श्वसन mitochondrial बातचीत, आकृति विज्ञान और जैव रसायन सहित विभिन्न नियामक प्रभावों को प्रतिबिंबित कर सकते हैं.
Abstract
Mitochondrial समारोह की जांच हृदय शरीर क्रिया विज्ञान के एक महत्वपूर्ण पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में ऊर्जा चयापचय, oxidative तनाव, apoptosis, उम्र बढ़ने, mitochondrial encephalomyopathies और दवा विषाक्तता में mitochondria शामिल हैं. यह देखते हुए, हृदय mitochondrial समारोह को मापने के लिए प्रौद्योगिकियों की मांग कर रहे हैं. एक तकनीक है कि mitochondrial समारोह को मापने के लिए एक एकीकृत दृष्टिकोण को रोजगार respirometric oxidative phosphorylation विश्लेषण (OXPHOS) है.
respirometric OXPHOS मूल्यांकन के सिद्धांत क्लार्क इलेक्ट्रोड का उपयोग ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने के आसपास केंद्रित है. Permeabilized फाइबर बंडल के रूप में बंद कक्ष में गिरावट ऑक्सीजन, ऑक्सीजन एकाग्रता की खपत. चयनित सब्सट्रेट - अवरोध करनेवाला - uncoupler अनुमापन प्रोटोकॉल का प्रयोग, इलेक्ट्रॉनों इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के विशिष्ट साइटों के लिए प्रदान की जाती हैं, mitochondrial समारोह के मूल्यांकन की अनुमति है. Mitochondrial समारोह के respirometric विश्लेषण से पहले, यांत्रिक और रासायनिक तैयारी तकनीक का उपयोग कर रहे हैं मांसपेशी फाइबर के sarcolemma permeabilize. रासायनिक permeabilization सैपोनिन रोजगार के चुनिंदा कोशिका झिल्ली छेदना जबकि सेलुलर वास्तुकला को बनाए रखने.
इस कागज को अच्छी तरह से ऑक्सीजन की खपत के मापन के लिए सैपोनिन चमड़ी हृदय फाइबर की तैयारी mitochondrial OXPHOS का मूल्यांकन करने में शामिल कदम का वर्णन करता है. इसके अतिरिक्त, विशिष्ट substrates के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सलाह समस्या निवारण की आवश्यकता है, inhibitors और uncouplers कि इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के विशिष्ट स्थलों पर mitochondria समारोह का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान की जाती हैं. महत्वपूर्ण बात, वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से विभिन्न पशु मॉडल और मानव नमूनों के हृदय और कंकाल ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
1. अभिकर्मक तैयार
- विश्राम संरक्षण और समाधान (आरपी समाधान) के रूप में पहले मामूली संशोधनों के साथ 1 में वर्णित के लिए तैयार है. संक्षेप में, आरपी समाधान 2.77mM cak EGTA 2, 7.23mM कश्मीर 2 EGTA, 20mm imidazole, 0.5mm dithiothreitol, 20mm taurine, 50mm कश्मीर - एमईएस, 6.56 MgCl 2, 5.7mM एटीपी, 14.3mM phosphocreatine, 7.1 पीएच समायोजित के होते हैं कमरे के तापमान (आर टी) में. एक 0.45-सुक्ष्ममापी बाँझ फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर. 15 एमएल -20 (फाल्कन polypropylene ट्यूब) और भाग दुकान में फूट डालो डिग्री सेल्सियस व्यंजनों के लिए चर्चा देखें.
- Mitochondrial Respirometry समाधान (MiR05) के रूप में पहले 2 में वर्णित तैयार है और 0.5mm EGTA, 3mm 2 MgCl 0.6 एच 2 हे, 20mm taurine, 10mm 2 के.एच. पीओ 4, 20mm HEPES, 1g / एल BSA, 60mm पोटेशियम lactobionate 110mm, शामिल sucrose, पीएच 7.1, 30 में समायोजित डिग्री सेल्सियस एक 0.45-सुक्ष्ममापी बाँझ फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर. -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल (फाल्कन polypropylene ट्यूब) भागों और दुकान में फूट डालो व्यंजनों के लिए चर्चा देखें. 30 में ऑक्सीजन MiR05 के लिए विलेयता कारक डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस 3 .92.
2. ऊतक तैयार
ए कार्डिएक यांत्रिक तैयारी फाइबर
- प्रक्रियाएं कैलगरी पशु देखभाल के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया और समिति का प्रयोग करें और प्रयोग के लिए प्रयोगशाला पशु विज्ञान के दिशा निर्देशों के लिए कनाडा के एसोसिएशन द्वारा पालन.
- सरवाइकल के लिए माउस को स्थिर अव्यवस्था के लिए पसंदीदा तरीका है. वैकल्पिक रूप से, intraperotineal ketamine और xylazine के इंजेक्शन (आईपी) (80 10mg/kg और, क्रमशः) या pentobarbital सोडियम की 0.5mg/kg प्रशासित किया जा सकता है. नोट: pentobarbital सोडियम NADH डिहाइड्रोजनेज (जटिल मैं) 4 के एक प्रतिवर्ती अवरोध करनेवाला है.
- दिल निकालें और यह एक बर्फ (चित्रा 1 ए) पर आरपी समाधान युक्त पेट्री डिश में जगह. ध्यान से किसी भी संयोजी ऊतक और / या वसा एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हटा दें.
- पट के साथ आधे में दिल काटें. उत्पाद शुल्क 10 25mg ऊतक के गीला (ww) endocardium बाएं वेंट्रिकल की सतह (चित्रा 1 बी) से काटने से वजन. चीरा फाइबर अभिविन्यास के साथ है सुनिश्चित करने के लिए मायोकार्डियम के लिए यांत्रिक क्षति कम से कम.
- एक पेट्री डिश अलग बर्फ पर आरपी समाधान युक्त में dissected ऊतक के subsample रखें. एक विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग अनुदैर्ध्य स्ट्रिप्स में फाइबर उन्मुखीकरण के साथ 1-1.5mm के एक व्यास के साथ दिल कटौती.
- 2-4mm (चित्रा 1C) की लंबाई के लिए एक स्केलपेल के साथ स्ट्रिप्स छोटा.
- चरम देखभाल और तेज संदंश यंत्रवत् अलग फाइबर बंडलों का उपयोग करना. अंतिम फाइबर बंडलों 6-8 तंतुओं के एक अधिकतम, संपर्क के छोटे क्षेत्रों से जुड़ा हुआ है, 5mg ww से कोई अधिक वजन होना चाहिए. 1-3mg ww के कार्डिएक फाइबर की सिफारिश कर रहे हैं. नेत्रहीन, हृदय ऊतक मूल लाल से एक हल्के गुलाबी रंग (चित्रा 1D) बदलना चाहिए.
बी कार्डिएक फाइबर बंडलों रासायनिक तैयारी
- बर्फ पर एक 12 अच्छी तरह से थाली प्लेस.
- आरपी करने के लिए कम से कम कैल्शियम 5 संदूषण समाधान के साथ अच्छी तरह से (ओं) कुल्ला.
- यंत्रवत् तैयार फाइबर बंडलों को एक अच्छी तरह से युक्त 3ml बर्फ ठंड 50ug / एमएल सैपोनिन के साथ आरपी समाधान के लिए स्थानांतरण. नोट: saponin की एकाग्रता समाधान हृदय की मांसपेशी में मौजूद की राशि पर निर्भर नहीं करता है.
- बर्फ पर हल्के सरगर्मी के साथ 20min के लिए सेते हैं.
सी. कार्डिएक फाइबर बंडल धुलाई
- MiR05 के साथ एक नया अच्छी तरह कुल्ला करने के लिए कम से कम कैल्शियम 5 संदूषण .
- नए अच्छी तरह से युक्त बर्फ ठंड 10ml MiR05 हृदय बंडलों स्थानांतरण. बर्फ पर हल्के सरगर्मी के साथ 10min के लिए सेते हैं.
- (1-2) ताजा MiR05 के साथ 2-3 बार दोहराएँ. दोहराव धोने कदम को हटाने या saponin, एटीपी, ADP और फाइबर बंडलों से किसी भी शेष substrates सुनिश्चित कर रहे हैं.
डी. गीले वजन दृढ़ संकल्प
- सीधे सांस विश्लेषण करने से पहले, गीला वजन एक शोषक सतह संदंश का उपयोग (फिल्टर पेपर) पर व्यक्तिगत फाइबर बंडलों (ww 1 - 3mg) सोख्ता और 5s के लिए सतह के लिए फाइबर पकड़े द्वारा प्राप्त होता है या जब तक सभी नमी दूर दुष्ट है.
- दूसरे शोषक सतह का प्रयोग, संदंश से अधिक तरल निकालने.
- पैमाने धड़ा और एक प्लास्टिक फाइबर बंडल जगह बड़े पैमाने पर माप के लिए नाव तौलना.
- MiR05 बर्फ ठंड के साथ एक नए तरह हृदय फाइबर बंडल स्थानांतरण. फाइबर बंडल ऑक्सीजन की खपत के आकलन के लिए तैयार है.
3. Respirometric OXPHOS विश्लेषण
ए Respirometric उपकरण
- प्रयोगशाला का इस्तेमाल की सिफारिश की और एक दो कक्ष oxygraph अनुमापन इंजेक्शन (Oroboros Oxygraph2 कश्मीर, Oroboros उपकरण). कश्मीर Oxygraph - दो महत्वपूर्ण भूमिका निभाई हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर (DatLab) कि महत्वपूर्ण भूमिका निभाई पृष्ठभूमि कम से कम का उपयोग करके बड़े हिस्से में उच्च संकल्प respirometry कि योगदान प्रदान करता हैऑक्सीजन की खपत कलाकृतियों.
- Oxygraph के अंशांकन वाद्य ऑक्सीजन की खपत के confounding प्रभाव को कम करने के लिए एक आवश्यक कदम है. अंशांकन थोड़ा oxygraph पर निर्भर करता है. Oxygraph विशिष्ट प्रक्रियाओं के लिए उपयोगकर्ता पुस्तिका का संदर्भ लें.
बी प्रतिनिधि गुणवत्ता मान्यता / नियंत्रण तकनीक प्रोटोकॉल
- MiR05 oxygraph कक्षों आवास के लिए जोड़ा गया है polarographic ऑक्सीजन सेंसर (Pos) और हवा और MiR05 की संतृप्ति संतुलन के लिए 37 पर पर्याप्त समय देना ° सी पहले oxygraph कक्षों में murine हृदय तंतुओं डालने के लिए सुनिश्चित करें.
- हृदय फाइबर नमूने oxygraph कक्षों की हड़कंप मच गया MiR05 में रखा जाता है. नोट: सुनिश्चित करें हलचल सलाखों PVDF या तिरछी नज़र-लेपित दोषी सलाखों (6mm व्यास).
- ऑक्सीजन से भरे एक सिरिंज का उपयोग 250-550uM oxygraph कक्षों की ऑक्सीजन एकाग्रता में वृद्धि. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऑक्सीजन एकाग्रता हवा संतृप्ति 6 ऊपर भी 50% पर permeabilized फाइबर की तैयारी के लिए सीमित है. ऑक्सीजन एकाग्रता स्थिरीकरण के लिए 5-10min की अनुमति दें.
- 25μL हैमिल्टन microsyringe का प्रयोग, 2M और 800mm Malate के ग्लूटामेट 5μL के 10μL जोड़ने 10mm और 2mm की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, क्रमशः. इन titrations बेसल जटिल मैं समर्थित श्वसन (, ADP के अभाव राज्य 2) के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं. ऑक्सीजन का प्रवाह अनुमापन के लगभग 5min के भीतर स्थिर चाहिए. समुचित तैयारी बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य राज्य 2 ऑक्सीजन की खपत प्रदान करना चाहिए.
- स्थिर ऑक्सीजन की खपत के 2 5min बाद, 5mm (saturating) अंतिम एकाग्रता के लिए 500mm ADP के 20μL जोड़ने के लिए, एक 25μL हैमिल्टन microsyringe का उपयोग करते हुए, के माध्यम से अधिक से अधिक (राज्य 3) mitochondrial श्वसन के लिए जटिल मैं कुछ अध्ययन के एक एकाग्रता की इस उच्च का उपयोग करें ADP के, तथापि, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें करने के लिए है कि 90% से अधिक की संतृप्ति केवल 7 5mm ऊपर सांद्रता में तक पहुँच जाता है.
- स्थिर ऑक्सीजन की खपत के 2 5min बाद, 5μL 4mm साइटोक्रोम ग के जोड़ने के लिए 10μM के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, एक 10μL हैमिल्टन microsyringe बाहरी mitochondrial (OMM) झिल्ली अखंडता के गुणवत्ता नियंत्रण के विश्लेषण के लिए,.
- स्थिर ऑक्सीजन की खपत के 2 5min बाद, 4mg / एमएल oligomycin के 1μL जोड़ने के लिए, एक 10μL हैमिल्टन microsyringe का उपयोग कर, एटीपी synthase को बाधित. यह अनुमापन कदम भीतर mitochondria झिल्ली intactness के सत्यापन की पेशकश करेगा.
- Respirometric OXPHOS आकलन के बाद. नमूना सूखी वजन या mitochondrial मार्कर दृढ़ संकल्प के लिए बनाए रखा है.
- Oxygraph के गिलास कक्षों से MiR05 निकालें. कक्षों आसुत जल (2 हे DDH) के साथ कम से कम तीन बार धोएं .
- कक्षों 100% (EtOH) इथेनॉल जैसे oligomycin EtOH घुलनशील inhibitors को हटाने के साथ कम से कम तीन बार धोएं.
- 70% EtOH तीन बार के साथ कक्षों के साथ अंतिम 70% EtOH oxygraph कक्षों बाँझ स्थायी 30min धो धो.
- पिछले MiR05 के नए प्रयोगात्मक अनुमापन प्रोटोकॉल के लिए इसके अलावा यह सुनिश्चित करें स्थिति युक्त कक्षों DDH 2 ओ के साथ कम से कम पांच बार धो रहे हैं
- मान्यता titrations एक व्यक्ति (चित्रा 2) प्रोटोकॉल या titrations के रूप में किया जा सकता है एक अच्छी तरह से योजना बनाई अनुमापन respirometry अध्ययन के प्रायोगिक और नैदानिक उद्देश्य पर निर्भर करता है प्रोटोकॉल में शामिल किया जा सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
अच्छी तरह से तैयार murine हृदय तंतुओं में आक्सीजन की खपत गुणवत्ता नियंत्रण प्रोटोकॉल द्वारा मूल्यांकन किया जाता है के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है. 3-5 आंकड़े गलत तरीके से तैयार हृदय तंतुओं के सामान्यतः सामना करना पड़ा उदाहरण प्रदान करते हैं. श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड) respirometry में एक महत्वपूर्ण सूचकांक का प्रतिनिधित्व करता है. इस पैरामीटर ऑक्सीजन की खपत और oxidative phosphorylation के बीच युग्मन इंगित करता है. Permeabilized फाइबर की तैयारी में, रेसकोर्स रोड राज्य राज्य भर में 4 3 2 राज्य या वैकल्पिक रूप से तीन राज्य के सापेक्ष (oligomycin और / या atractyloside, एटीआर द्वारा प्रेरित) में श्वसन की दर है. इसके अलावा, रेसकोर्स रोड गुणवत्ता आश्वासन मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और प्रयोगात्मक या रोग हस्तक्षेप से 5 परिणामस्वरूप युग्मन में परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं. खैर मिलकर permeabilized murine हृदय तैयारी ऊष्मायन 1 का उपयोग समाधान, 8, 9 के आधार पर 3-6 के बीच एक रेसकोर्स रोड उपज.
साइटोक्रोम ग के अनुमापन उचित ऊतक की तैयारी के एक मान्यता के रूप में प्रयोग किया जाता है. साइटोक्रोम ग एक प्रोटीन mitochondrial भीतरी झिल्ली 10 पर intermembrane अंतरिक्ष में स्थित है. अंतर्जात साइटोक्रोम ग, जब mitochondria की बाहरी झिल्ली बरकरार है intermembrane अंतरिक्ष में रहता है और exogenous साइटोक्रोम ग के अनुमापन श्वसन (चित्रा 2) पर एक प्रभाव नगण्य है. यदि mitochondria की बाहरी झिल्ली क्षतिग्रस्त है, अंतर्जात साइटोक्रोम ग intermembrane अंतरिक्ष से जारी किया जा सकता है श्वसन और exogenous साइटोक्रोम तक बाधित करेगाग के अलावा (चित्रा 3). समुचित तैयारी ऑक्सीजन प्रवाह में केवल एक मामूली 5-15% रेंज में 5 साइटोक्रोम ग इसके अलावा निम्नलिखित ऊंचाई का अनुभव करना चाहिए . इसके अतिरिक्त, इस प्रयोगात्मक अनुमापन mitochondrial बाहरी झिल्ली intactness पर रोग या प्रयोगात्मक stressor के प्रभाव के आकलन के लिए अनुमति देता है. यदि साइटोक्रोम ग प्रभाव अनुभवी है, ऊतक और / या सैपोनिन एकाग्रता कम यांत्रिक तैयारी के दौरान देखभाल सुनिश्चित करते हैं.
oligomycin और / या एटीआर के अलावा रिसाव श्वसन में परिवर्तन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ADP 11 phosphorylation के लिए ऑक्सीजन की खपत नहीं योगदान. इसके अतिरिक्त, इस अनुमापन कदम उचित नमूना तैयार करने के एक मान्यता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. नियंत्रण या जंगली प्रकार फाइबर इस सुविधा के प्रति संवेदनशील हो सकता है और ऑक्सीजन के प्रवाह में एक महत्वपूर्ण कमी का अनुभव करना चाहिए. एक कम रेसकोर्स रोड और oligomycin और / या एटीआर एक अपेक्षाकृत ऊंचा ऑक्सीजन प्रवाह में जिसके परिणामस्वरूप कम संवेदनशीलता तैयारी के दौरान आंतरिक mitochondrial झिल्ली (चित्रा 4) के लिए नुकसान का संकेत है. नुकसान की संभावना हृदय तंतुओं के यांत्रिक जुदाई के दौरान प्रेरित है भीतरी mitochondrial झिल्ली के रूप में कम सैपोनिन रिश्तेदार द्वारा अपमान बाहरी mitochondrial झिल्ली के लिए अतिसंवेदनशील है. हालांकि, दोनों यांत्रिक और रासायनिक तैयारी तदनुसार समायोजित किया जा करने के लिए अनुचित तरीके से तैयार हृदय 5 फाइबर, 12 से बचने के हो सकता है.
सैपोनिन चमड़ी चूहों से फाइबर बंडलों आरपी समाधान में 2 से अधिक के लिए 6 से अधिक या MiR05 समाधान के लिए नहीं रहना चाहिए. सब्सट्रेट - अवरोध करनेवाला - uncoupler titrations के रूप में चित्रा 5 में देखा करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी लंबे समय तक ऊष्मायन अवधि के संकेत हो सकता है. बाद प्रयासों पशु बलि और ऑक्सीजन की खपत माप के बीच समय कम से कम करना चाहिए.
चित्रा 1 murine हृदय फाइबर बंडलों के यांत्रिक तैयारी. ए पूरे दिल तुरंत निम्नलिखित विच्छेदन. बी 10-25mg पूर्वकाल बाएं वेंट्रिकल का एक नमूना. सी. कार्डिएक ऊतक 1mm व्यास और 2-4mm लंबाई स्ट्रिप्स में विभाजित है. डी. अंतिम हृदय फाइबर बंडलों saponin के साथ रासायनिक permeabilization के लिए तैयार.
चित्रा 2 उचित ऊतक polarographic मूल्यांकन का उपयोग तैयारी के प्रतिनिधि परिणाम है . राज्य 2 ऑक्सीजन का प्रवाह जटिल मैं substrates ग्लूटामेट और Malate (एम / G) द्वारा समर्थित है और काफी ADP (राज्य 3) के अलावा निम्नलिखित उत्तेजित. Exogenous साइटोक्रोम ग अलावा कोई stimulatory प्रभाव को इंगित करता है बाहरी mitochondrial झिल्ली बरकरार है. ऑक्सीजन की खपत के oligomycin संवेदनशीलता का पता चलता है भीतर mitochondrial झिल्ली अखंडता बरकरार है. 2 एमएल बंद कक्ष में ऑक्सीजन एकाग्रता नीली रेखा द्वारा पहचाना जाता है. 2 एमएल बंद कक्ष में हृदय ऊतक के नमूने के ऑक्सीजन की खपत लाल रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. Malate और ग्लूटामेट, एम / जी, Adenosine diphosphate, ADP, साइटोक्रोम सी, cyto ग; Oligomycin, ओ
चित्रा 3. साइटोक्रोम ग प्रभाव सत्यापन परीक्षण polarographic मूल्यांकन का उपयोग . राज्य 2 ऑक्सीजन का प्रवाह जटिल मैं substrates ग्लूटामेट और Malate (एम / G) द्वारा समर्थित है और काफी ADP (राज्य 3) के अलावा निम्नलिखित उत्तेजित. Exogenous साइटोक्रोम ग अलावा के stimulatory प्रभाव को इंगित करता है कि बाहरी mitochondrial झिल्ली अखंडता समझौता किया है. 2 एमएल बंद कक्ष में ऑक्सीजन एकाग्रता नीली रेखा द्वारा पहचाना जाता है. 2 एमएल बंद कक्ष में हृदय ऊतक के नमूने के ऑक्सीजन की खपत लाल रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. Malate और ग्लूटामेट, एम / G, Adenosine diphosphate, ADP, साइटोक्रोम सी, cyto सी.
4 चित्रा इनर mitochondrial झिल्ली अखंडता सत्यापन परीक्षण polarographic मूल्यांकन का उपयोग . राज्य 2 ऑक्सीजन का प्रवाह जटिल मैं substrates ग्लूटामेट और Malate (एम / जी) और ऑक्सीजन की खपत का एक अपेक्षाकृत कमजोर ADP (राज्य 3) के अलावा निम्नलिखित उत्तेजना द्वारा समर्थित है. ऑक्सीजन की खपत के गरीब oligomycin संवेदनशीलता का पता चलता है भीतरी mitochondrial झिल्ली क्षतिग्रस्त है. 2 एमएल बंद कक्ष में ऑक्सीजन एकाग्रता नीली रेखा द्वारा पहचाना जाता है. 2 एमएल बंद कक्ष में हृदय ऊतक के नमूने के ऑक्सीजन की खपत लाल रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. Malate और ग्लूटामेट, एम / G, Adenosine diphosphate, ADP Oligomycin, ओ
चित्रा 5 MiR05 में लंबे समय तक ऊष्मायन निम्नलिखित Polarographic मूल्यांकन. आक्सीजन की खपत ADP के अलावा के बाद ग्लूटामेट और Malate exogenous अलावा (एम / जी) और ऑक्सीजन की खपत के लिए असंवेदनशील है (3 राज्य) कम है. Exogenous साइटोक्रोम ग इसके अलावा और ऑक्सीजन oligomycin खपत की असंवेदनशीलता का कोई stimulatory प्रभाव है अनुभवी है. Extramitochondrial ऊष्मायन समाधान जोड़ने के जवाब की कमी का पता चलता है mitochondrial कार्यात्मक स्थिरता समझौता किया है. 2 एमएल बंद कक्ष में ऑक्सीजन एकाग्रता नीली रेखा द्वारा पहचाना जाता है. 2 एमएल बंद कक्ष में हृदय ऊतक के नमूने के ऑक्सीजन की खपत लाल रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. Malate और ग्लूटामेट, एम / G, Adenosine diphosphate, ADP, साइटोक्रोम सी, cyto सी.
1. नोट: अभिकर्मक तैयार
कश्मीर 2 EGTA 100mm स्टॉक समाधान की तैयारी
| अभिकर्मक के नाम | अंतिम एकाग्रता (मिमी) | g/100 एमएल एच 2 हे |
| Ethylene glycol बीआईएस (2 aminoethylether) - एन, एन, एन, एन 'tetraacetic एसिड (EGTA) | 100 | 3.805 |
| पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH) | 200 | 1.15 |
नोट: 7.4 करने के लिए कमरे के तापमान पर पीएच समायोजित.
Ca 2 EGTA 100mm स्टॉक समाधान की तैयारी
| अभिकर्मक के नाम | अंतिम एकाग्रता (मिमी) | g/100 एमएल एच 2 हे | टिप्पणियां (वैकल्पिक) |
| Ethylene glycol बीआईएस (2 aminoethylether) - एन, एन, एन, एन 'tetraacetic एसिड (EGTA) | 100 | 3.805 | 80 से हीट डिग्री सेल्सियस और हल्का हलचल. |
| कैल्शियम कार्बोनेट (3 CaCO) | 100 | 1.001 | कैल्शियम एकाग्रता के रूप में सटीक होना कैल्शियम विभिन्न organelles mitochondria सहित समारोह को नियंत्रित करना चाहिए. सभी 3 CaCO के पूरा solubilization सुनिश्चित करें. अंतिम समाधान पूरी तरह से पारदर्शी होना चाहिए. CaCO 3 शुरू EGTA और कुछ पानी के साथ मिलाया जाता है कार्बोनिक एसिड और सीओ 2 वाष्पीकरण के गठन को सक्रिय करने के लिए. यह प्रतिक्रिया 80 हीटिंग के द्वारा त्वरित किया जा सकता डिग्री सेल्सियस |
| पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH) | 200 | 1.15 | KOH के साथ बेअसर सीओ 2 के वाष्पीकरण के बाद पूरा हो गया है . |
नोट: 7.4 करने के लिए कमरे के तापमान पर पीएच समायोजित.
विश्राम और संरक्षण (आरपी समाधान) समाधान 1 की तैयारी
| अभिकर्मक | अंतिम एकाग्रता (मिमी) | प्रति लीटर | टिप्पणियाँ |
| कश्मीर 2 EGTA | 7.23 | 72.3 एमएल | |
| Cak 2 EGTA | 2.77 | 27.7 एमएल | |
| Imidazole | 20 | 1.36g | |
| Dithiothreitol | 0.5 | ||
| Taurine | 20 | 2.52g | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium नमक हाइड्रेट (एटीपी) | 5.7 | 3.14g | |
| Phosphocreatine (पीसीआर) | 14.3 | 4.0g | |
| मैग्नीशियम क्लोराइड (2 MgCl) | 6.56 | 0.624g | |
| K-एमईएस | 50 | 14.0g |
नोट: 7.1 करने के लिए कमरे के तापमान पर पीएच समायोजित
Mitochondrial Respirometry समाधान की तैयारी (MiR05 समाधान) 2
| अभिकर्मक | अंतिम एकाग्रता (मिमी) | प्रति लीटर | टिप्पणियां (वैकल्पिक) |
| Ethylene glycol बीआईएस (2 aminoethylether) - एन, एन, एन, एन 'tetraacetic एसिड (EGTA) | 0.5 | 0.190g | कैल्शियम की एक chelator के रूप में प्रयुक्त |
| मैगनीशियम क्लोराइड hexahydrate (MgCl 2 0.6 एच 2 हे) | 3.0 | 0.610g | फाइबर की तैयारी के 2 मिलीग्राम बिना गुणवत्ता परीक्षण नहीं किया जा + कर सकते हैं. |
| Taurine | 20.0 | 2.502g | Taurine एक झिल्ली स्थिरता और एंटीऑक्सीडेंट है. 20mm दिल में मौजूद intracellular एकाग्रता है. |
| पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार का (2 के.एच. 4 पीओ) | 10.0 | 1.361g | |
| 20.0 | 4.77g | ||
| पोटेशियम - lactobionate | 60.0 | 0.5 एम के 120 एमएल K-lactobionate स्टॉक | 0.5m कश्मीर lactobionate स्टॉक: 100 एमएल एच 2 हे और आरटी पर 7.0 पीएच 35.83 छ lactobionic एसिड जोड़ें. 200 एमएल DDH 2 ओ के साथ मात्रा समायोजित उच्च intracellular + K एकाग्रता को दोहराने के लिए प्रयुक्त. पहले KCl इस्तेमाल किया गया था, तथापि, उच्च mitochondrial creatine kinase समारोह Cl-रोकता है. |
| Sucrose | 110.0 | 37.65g | एक ROS मेहतर के रूप में प्रयुक्त. |
| गोजातीय सीरम albumin (BSA) | / 1g एल | 1g | एक झिल्ली स्थिरता प्राप्त करने, एंटीऑक्सिडेंट, और कैल्शियम और मुक्त फैटी एसिड की chelator के रूप में प्रयुक्त. |
नोट: 7,1 करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर पीएच समायोजित
3. नोट: Respirometric OXPHOS विश्लेषण
बी चुनें Substrates uncouplers, और inhibitors
Mitochondrial Respirometry विश्लेषण के लिए चयनित Substrates की सूची
| सब्सट्रेट | [स्टॉक] | तैयार | दो एमएल प्रति वॉल्यूम | [अंतिम] | टिप्पणियाँ |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium नमक dihydrate (ADP) | 500mm | 246mg / एमएल DDH 2 ओ आरटी में 7.1 करने के लिए पीएच को समायोजित करें. -80 पर स्टोर ° सी 250 μL aliquots में. | 20ul | 5mm | को बनाए रखने के लगातार 2 मिलीग्राम + + respirometry प्रयोगों के दौरान 0.6 mol 2 MgCl / mol ADP जोड़ें . |
| एस्कॉर्बेट | 800mm | 0.1584g / एमएल DDH 2 ओ -20 डिग्री सेल्सियस पर 200 μL aliquots में स्टोर. संवेदनशील लाइट | 5 μL | 2mm | जब TMPD के साथ समानांतर में इस्तेमाल किया सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है. ऑटो ऑक्सीकरण के लिए ऑक्सीजन का प्रवाह के लिए सही होगा. |
| साइटोक्रोम सी | 4mm | 50mg / एमएल DDH 2 ओ -20 डिग्री सेल्सियस पर 250 μL aliquots में स्टोर. | 5 μL | 10um | |
| साइनाइड कार्बोनिल (trifluoromethoxy) पी phenylhydrazone (FCCP) | 0.1mm | 0.254mg/10 एमएल 100% EtOH. 500 μL aliquots में कांच की शीशियों में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर. | 1 μL के कदम | एक uncoupler रूप में कार्य करता है. अधिक से अधिक इलेक्ट्रॉन परिवहन क्षमता और phosphorylation प्रणाली द्वारा इलेक्ट्रॉन परिवहन के किसी भी सीमा निर्धारित करता है. | |
| ग्लूटामेट | 2M | 0.3742g / एमएल DDH 2 ओ आरटी में 7.1 करने के लिए पीएच को समायोजित करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर 250 μL aliquots में स्टोर. | 10ul | 10mm | NADH डिहाइड्रोजनेज के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है (मैं जटिल). |
| Malate | 800mm | 0.1073g / एमएल DDH 2 ओ आरटी में 7.1 करने के लिए पीएच को समायोजित करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर 250 μL aliquots में स्टोर. | 5ul | 2mm | NADH डिहाइड्रोजनेज के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है (मैं जटिल). अकेले श्वसन का समर्थन नहीं कर सकते. |
| पाइरूवेट | 1M | 11mg/0.1 एमएल DDH 2 ओ ताजा तैयार. | 5 μL | 2.5mm | NADH डिहाइड्रोजनेज के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है (मैं जटिल). |
| Succinate | 1000mm | 1.3505g / 5 एमएल DDH 2 ओ आरटी में 7.1 करने के लिए पीएच को समायोजित करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर 250 μL aliquots में स्टोर. | 20ul | 10mm | Succinate डिहाइड्रोजनेज (जटिल द्वितीय) के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है. |
| एन, एन, एन, N'- Tetramethyl pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | 200mm | 47.1mg / एमएल DDH 2 ओ 10mm के अंतिम एकाग्रता 0.8M एस्कॉर्बेट जोड़ें ऑटो ऑक्सीकरण 200 μL aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर को रोकने के लिए. | 5 μL | 0.5mm | नीले रंग की उपस्थिति से स्पष्ट शेयर समाधान के Autoxidation. जब TMPD के साथ समानांतर में इस्तेमाल किया सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है. ऑटो ऑक्सीकरण के लिए ऑक्सीजन का प्रवाह के लिए सही होगा. |
Mitochondrial Respirometry विश्लेषण के लिए चयनित Inhibitors की सूची
| सब्सट्रेट | [स्टॉक] | तैयार | 2 एमएल चैंबर प्रति वॉल्यूम | [अंतिम] | टिप्पणियाँ |
| Antimycin एक | 5mm | 27.4mg/10 एमएल 100% EtOH. -20 डिग्री सेल्सियस पर 250 μL aliquots में स्टोर. | 1 μL | 2.5μM | Coenzyme क्यू के अवरोध करनेवाला: साइटोक्रोम ग oxidoreductase (परिसर III) </ P> |
| Atractyloside | 50mm | 40mg / एमएल DDH 2 ओ -20 डिग्री सेल्सियस पर 250 μL aliquots में स्टोर. | 30 μL | 0.75mM | एटीपी Synthase का अवरोध करनेवाला. |
| Oligomycin | 4mg एमएल / | 4mg / एमएल 100% EtOH. -20 डिग्री सेल्सियस पर 200 μL aliquots में स्टोर. | 1 μL | एटीपी synthase के अवरोध करनेवाला. | |
| साइनाइड पोटेशियम | 1M | 65.1mg / एमएल DDH 2 ओ ताजा तैयार. आरटी में 7.1 करने के लिए पीएच समायोजित | 1 μL | 1mm | साइटोक्रोम ग oxidase अवरोध करनेवाला (जटिल चतुर्थ). निम्नलिखित TMPD और एस्कॉर्बेट autoxidation का उपयोग अनुमापन का उपयोग. |
| Rotenone | 0.1mm | 0.39mg/10 एमएल 100% EtOH. -20 डिग्री सेल्सियस पर 250 μL aliquots में स्टोर. संवेदनशील लाइट. | 1 μL | 0.05μM | NADH डिहाइड्रोजनेज के अवरोध करनेवाला (जटिल मैं). उच्च सांद्रता, आवश्यक हो सकता है तथापि, rotenone प्रतिधारण को कम करने के लिए चैम्बर में शुरू के रूप में रेखांकित है. |
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Discussion
सैपोनिन permeabilized हृदय फाइबर तकनीक और mitochondrial OXPHOS ऑक्सीजन की खपत के vivo मूल्यांकन में इन विट्रो में के बीच एक अद्वितीय समझौता प्रदान करता है . इस तकनीक का लाभ सेलुलर वास्तुकला के रूप में अलग mitochondria की तुलना में शारीरिक प्रासंगिकता बढ़ शामिल है संरक्षित. जबकि प्लाज्मा झिल्ली अपमानित है, 12 mitochondria सहित intracellular झिल्ली संरचनाओं, 14, 14 sarcoplasmic जालिका, myofilaments और cytoskeleton 1, 17 बरकरार रहेगा. इसके अलावा, mitochondria और cytoskeleton 1, 17 के बीच बातचीत भी अनछुए हैं . Mitochondria permeabilized फाइबर में वृद्धि की स्थिरता दिखा. कृंतक फाइबर तैयारी 6 और मानव फाइबर नमूनों के लिए ठंडा preservations समाधान में संग्रहीत किया जा सकता 18,2 24 घंटों के लिए स्थिरता दिखाने . Mitochondria ऊष्मायन समाधान के साथ अनुभव तेजी से संतुलन. यह जोडी substrates, inhibitors और 1 uncouplers, 5 के जवाब में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के साइट विशिष्ट विश्लेषण पर सीधा नियंत्रण की अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, सीटू तकनीक में यह केवल ऊतक के कुछ मिलीग्राम की आवश्यकता है.
सैपोनिन चमड़ी फाइबर तकनीक की सीमाओं को नजरअंदाज नहीं किया जा सकता है. कार्डिएक mitochondria विषम हैं, दो subpopulations से मिलकर; subsarcolemmal और interfibrillar सीटू mitochondrial respirometry में 5 subpopulations के बीच भेद करने की क्षमता के बिना कुल mitochondrial जनसंख्या का आकलन. इसके अतिरिक्त, विभिन्न सेलुलर चयापचयों और साइटोसोलिक कारकों mitochondrial समारोह को विनियमित. हृदय तंतुओं के इन साइटोसोलिक घटक permeabilization vivo 5 वातावरण में सटीक पर mitochondrial आकलन असमर्थता में जिसके परिणामस्वरूप प्रक्रिया के दौरान खो रहे हैं .
रिपोर्टिंग मुद्दों पर एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय हैं. आक्सीजन की खपत माप गीला वजन या सूखी वजन के प्रति व्यक्त किया जा सकता है, तथापि, mitochondrial घनत्व सांस की प्रवाह विविधता में एक प्रमुख कारक है जब ऊतक 7 जन के प्रति व्यक्त की है. यह श्वसन दर और परिवर्तन के संदर्भ राज्य के चुनाव से बहुत प्रभावित हैं कि व्याख्या को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. Permeabilized फाइबर में respirometric OXPHOS परिणामों के प्रत्यक्ष तुलना के लिए, दर mitochondrial डीएनए, साइट्रेट synthase गतिविधि, साइटोक्रोम ग oxidase गतिविधि, और / या साइटोक्रोम aa3 19 सामग्री जैसे एक आम संदर्भ मार्कर के सापेक्ष व्यक्त किया जाना चाहिए .
सारांश में, permeabilized फाइबर respirometry विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया तैयारी हृदय mitochondria की एकीकृत समारोह के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. विभिन्न रोग राज्यों और आनुवंशिक मॉडल इस तकनीक का उपयोग किया है. ये दवा प्रेरित विषाक्तता का मूल्यांकन, उम्र बढ़ने, मधुमेह, congestive दिल विफलता, इस्कीमिक चोट और mitochondrial 5 फिजियोलॉजी, 20 पर oxidative तनाव के शामिल हैं . कई उत्कृष्ट methodological समीक्षाएँ और फाइबर सैपोनिन permeabilized तकनीक और polarographic ऑक्सीजन की खपत मूल्यांकन के पांडुलिपियों पहले किया गया है 1, 5, 14, 20, प्रकाशित और अत्यधिक की सिफारिश कर रहे हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन के स्वास्थ्य अनुसंधान और जीनोम कनाडा कनाडा के संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था. जे एस वेतन चिकित्सा अनुसंधान, हार्ट और कनाडा के स्ट्रोक फाउंडेशन और कनाडा डायबिटीज एसोसिएशन के लिए अलबर्टा विरासत फाउंडेशन से समर्थन पुरस्कार रखती है. प्रयोगशाला फाइबर सैपोनिन permeabilized तकनीक के अधिग्रहण के दौरान Oroboros उपकरण की तकनीकी सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
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