Summary
Evaluatie van de motiliteit in de cavia distale colon met de gastro-intestinale motiliteit Monitor (GIMM) is een eenvoudig en simpel om te leren benadering van de voortstuwende motiliteit kwantitatief te evalueren in het maagdarmkanaal.
Abstract
De gastro-intestinale motiliteit Monitor (GIMM, Catamount Research and Development, St. Albans, VT) is een in vitro systeem dat propulsieve motiliteit in geïsoleerde delen van de cavia distale colon monitoren. Het complete systeem bestaat uit een computer, videocamera, verlichte orgel bad, peristaltische en verwarmd waterbad circulatiepompen, en aangepaste GIMM software te registreren en analyseren van gegevens. Vergeleken met traditionele methoden van toezicht colon peristaltiek, het GIMM systeem maakt continue, kwantitatieve evaluatie van de beweeglijkheid. De cavia distale colon baadt in warme, zuurstofrijke Krebs oplossing, en fecale pellets ingebracht in de orale uiteindelijk worden voortgestuwd langs het segment van de dikke darm met een snelheid van ongeveer 2 mm / sec. Films van de fecale pellets verder op het segment worden gevangen, en de GIMM software kan worden gebruikt de voortgang van de fecale pellet. De tarieven van de stuwende beweeglijkheid kan worden verkregen voor het hele segment of voor een bepaalde regio van belang. In aanvulling op de analyse van bolus-geïnduceerde beweeglijkheid patronen, kan spatiotemporele kaarten worden gemaakt van opgenomen video segmenten tot spontane motorische activiteit patronen te beoordelen. Toepassingen van dit systeem zijn farmacologische evaluatie van de effecten van de receptor agonisten en-antagonisten op propulsieve motiliteit, alsmede de beoordeling van de veranderingen die het gevolg zijn van pathofysiologische omstandigheden, zoals een ontsteking of stress. De cavia distale colon voortstuwende beweeglijkheid test, het gebruik van de GIMM-systeem is eenvoudig en gemakkelijk te leren, en het biedt een betrouwbare en reproduceerbare methode voor de beoordeling propulsieve motiliteit.
Protocol
1. De voorbereiding van Colon weefsel voor GIMM
- Om een segment van de distale colon voor te bereiden op de gastro-intestinale motiliteit Monitor (GIMM), de eerste plaats de geïsoleerde dubbele punt in het ijs-koud Krebs-oplossing (121 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 25 mM NaHCO 3 , 1,2 mM NaH 2 PO 4 en 8 mM glucose; belucht met 95% O 2 / 5% CO 2). Ruimen resterende mesenterium van de buitenmuur en een kleine incisie in de orale uiteindelijk zodat het kan worden onderscheiden wanneer geplaatst in het orgel bad. Opmerking: weefsel kan in ijswater Krebs oplossing blijven tot twee uur voorafgaand aan de experimenten.
- Vervolgens de positie van de instroom en uitstroom leidingen in het orgel bad, zodat ze buiten de camera veld om storing met het beeld overname. Continu perfuseren het orgel bad met voorverwarmde (37 ° C) zuurstofrijk (95%, 5% CO 2) Krebs's oplossing bij een debiet van 10 ml / min.
- Het bijhouden van de orale versus anale eindigt, pin een segment van de distale colon (minstens 5 cm) aan beide zijden in het orgel bad, zodat een geringe mate van laksheid, zodat het segment vrij kan bewegen tot 1 cm in het midden . De mondelinge eind moet de richting van de onderzoeker voor het gemak van het plaatsen van de fecale pellet. Colonic segmenten moet worden gespeld op dezelfde manier door dezelfde onderzoeker voor elk experiment binnen een bepaalde reeks experimenten, omdat de lengte en de spanning van het segment van invloed op de snelheid van de propulsieve motiliteit, met longitudinale stretch het verminderen van de snelheid van doorvoer (Dickson et al.. , 2007).
- Laat de voorbereiding in evenwicht gedurende tenminste 30 minuten.
2. Het opzetten van GIMM en data-acquisitie
- In het GIMM systeem wordt het colon segment in de perfusie kamer verlicht van onderen. Een digitale video camera aangesloten op een computer is gepositioneerd boven de kamer. Zorg ervoor dat zowel de licht verlichting bron en GIMM software zijn ingeschakeld.
- Na het opzetten van een nieuw experiment in de GIMM softwaretoepassing, begint de eerste proef door het invoegen van een epoxy-coating fecale pellet in de mondelinge einde van de colon-segment naar peristaltiek te starten. Klik op de camera tuimelschakelaar op de computer in te schakelen op de camera en op de opnameknop klikt om de opname te starten. De beweging van de pellet in de anale richting is opgenomen door de videocamera en de digitale films worden opgeslagen op een PC voor latere analyse. Wanneer de pellet is het einde van de colon-segment bereikt, klikt u op de opnameknop om de opname te stoppen.
- Voor het verkrijgen van een controle waarde voor de snelheid van voortstuwing, te beginnen met een colon segment van een gezond dier en zonder toepassing van drugs. Gedrag 3-5 proeven in een enkel preparaat, met een herstelperiode van vijf minuten tussen elke run.
- Voor het bepalen van de effecten van bepaalde voorwaarden of drugs op motiliteit, voer dan 3-5 trials / voorbereiding voor elke experimentele conditie. Daarnaast, voert elk experiment op ten minste vijf verschillende dubbele punten uit ten minste vijf verschillende dieren.
- In de analyse van de digitale films, is de mate van fecale pellets voortstuwing berekend als de tijd die nodig is voor een pellet te doorkruisen X cm van het colon segment.
3. Bouw van spatiotemporele Maps
- De digitale video's verkregen van de individuele GIMM runs kunnen worden omgezet in tijdruimtelijke kaarten de aangepaste GIMM software.
- Op de horizontale as, worden veranderingen in de dikke darm met een diameter uitgezet na verloop van tijd door het omzetten van het beeld van de dikke darm bij elke video frame aan een silhouet, en het berekenen en het omzetten van de diameter over de gehele lengte in de grijs-schaal. Het eindresultaat is dat de pellet en de gebieden van ontspanning zwart worden, terwijl de gebieden met krimp wit worden weergegeven.
- De afstand die de pellet door de dikke darm segment is vertegenwoordigd op de verticale as.
4. Vertegenwoordiger spatiotemporele Kaarten
- Hier worden representatief spatiotemporele kaarten met pellet beweeglijkheid in het colon segmenten onder verschillende experimentele omstandigheden. De y (verticale) as vertegenwoordigt pellet positie in de tijd, terwijl de x (horizontaal) as staat voor de afstand die de pellet gevorderd door de dikke darm segment.
- In de spatiotemporele kaart uit een controle dubbele punt (onbehandeld, normaal), zal de pellet lineair vooruitgang met een snelheid van ~ 2 mm / sec. In tegenstelling, kan de toediening van bepaalde geneesmiddelen of een ontsteking in de dikke darm leiden tot een verstoorde motiliteit patronen zoals gestopt beweeglijkheid en belemmerd beweeglijkheid.
- Resultaten van GIMM kan ook worden weergegeven als grafieken, waarbij de y-as de afstand in millimeters afgelegd door een pellet uitwerpselen en de x-as de tijd in seconden vertegenwoordigt. Bijvoorbeeld, de toediening van DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5), eenopiaat μ-receptor agonist, veroorzaakt een afname van de voortstuwende motiliteit in de dikke darm.
Discussion
Zenuw-gemedieerde voortstuwende beweeglijkheid in het maagdarmkanaal werd voor het eerst meer dan een eeuw geleden beschreven door Bayliss en Starling (Bayliss en Starling, 1899). Deze constatering heeft geleid tot de aanwijzing van de zenuwen van de darm als het enterisch zenuwstelsel (ENS), een aparte divisie van het autonome zenuwstelsel (Langley, 1921). Neurogene darmperistaltiek gaat rekken en / of mucosale stimulatie op een bepaald punt en reflex gemedieerde contracties boven, of mondeling tot het niveau van de stimulus en ontspanning in de aborale richting. Het resultaat is het genereren van een drukgradiënt die de luminale inhoud van een orale naar aborale richting stuwt. In de dunne darm van een verscheidenheid van soorten, en in de rat dikke darm, kan peristaltische golven van de contracties worden geactiveerd door infusie van vloeistof in het lumen van de segmenten van darm. In de cavia distale colon, kunnen natuurlijke of kunstmatige fecale pellets worden ingevoegd in de mondelinge einde van de dikke darm en hun vooruitgang langs het segment van de dikke darm kan gemakkelijk worden gecontroleerd. Zo, de cavia distale colon biedt een eenvoudige en nuttige test voor het onderzoeken van stuwende motiliteit in de darm.
Peristaltiek is een complexe neurale reflex dat een aantal van neuroactive verbindingen en receptoren betrokken zijn. Als gevolg hiervan, verbindingen die neurotransmissie beïnvloeden in de ENS effect op de snelheid van de propulsieve motiliteit. Serotonine, voornamelijk vrijgelaten uit enterochromaffiene cellen in het darmslijmvlies, is betrokken bij de initiatie van de peristaltische reflex. Met behulp van de cavia distale colon, Grider en zijn collega's toonden aan dat voortstuwende motiliteit wordt versterkt door intralumenal toediening van 5-HT 4-receptor agonisten (Foxx-Orenstein et al., 1998;.. Grider et al., 1998), terwijl het bad van de toepassing van 5 -HT 3 en 5-HT 4-receptor-antagonisten vermindert de snelheid van de aandrijving (Kadowaki et al., 1996;. Linden et al., 2003b).. Bovendien, remming van de serotonine transporter met serotonine selectieve heropname remmers (SSRI's) verhoogt peristaltiek bij lage concentraties, maar daalt de peristaltiek bij hogere concentraties, waarschijnlijk als gevolg van desensitisatie van 5-HT-receptoren (Kadowaki et al., 1996;.. Wade et al., 1996). Andere signaalmoleculen die bijdragen aan de cavia propulsieve motiliteit zijn acetylcholine handelend op nicotinereceptoren, dat is de primaire mediator van interneuronal signalering in de darmen. Het blokkeren van synaptische transmissie met de nicotine-receptor antagonist hexamethonium afneemt pellet aandrijving bij hoge concentraties, terwijl lagere concentraties hebben geen invloed op de snelheid van de aandrijving (Kadowaki et al., 1996).. Opiaten, en de opioïde receptor agonisten, al sinds lange tijd bekend dat remmende effecten op de gastro-intestinale motiliteit hebben, afname pellet voortstuwing in de cavia propulsieve motiliteit model (Foxx-Orenstein et al., 1998;.. Wood et al., 2009). Interessant, daikenchuto, een traditionele Japanse kruidengeneeskunde klinisch gebruikt om braken, buikpijn, en verstoorde motiliteit te behandelen, vermindert de snelheid van de pellet voortstuwing bij toediening met de opioïde-antagonist naloxon, en wanneer alleen wordt toegediend, resulteert in een omgekeerde peristaltiek (Wood et al.., 2009). Deze bevindingen illustreren het nut van de cavia voortstuwende beweeglijkheid model om de bijdragen van de verschillende verbindingen en hun receptoren op motiliteit patronen te beoordelen.
Een aantal studies hebben aangetoond dat een ontsteking leidt tot veranderingen in de elektrische en synaptische eigenschappen van de dikke neuronen (Linden et al., 2003a;.. Lomax et al., 2005), en dat deze veranderingen kunnen aanhouden weken na herstel van ontstekingen (Kräuter . et al., 2007; Lomax et al., 2007).. De impact van colitis-geïnduceerde neuroplastic veranderingen op propulsieve motiliteit kan worden onderzocht bij de cavia distale colon met behulp van de GIMM systeem. Dit systeem heeft verschillende voordelen ten opzichte van de traditionele methode van monitoring motiliteit, die propulsieve motiliteit beoordeelt door simpelweg de tijd te meten een fecale pellet reist een bepaalde afstand. Eerdere studies van de ontsteking-geïnduceerde neurale plasticiteit in de dikke darm hebben aangegeven is er een afname in de snelheid van de pellet voortstuwing (Linden et al., 2003a;.. Linden et al., 2005), nog meer recent onderzoek met behulp van de GIMM systeem is gebleken meer complexe veranderingen (Strong et al.., 2010). Zo is bijvoorbeeld de snelheid van de pellet voortstuwing daalde zweren regio's van de ontstoken distale colon, maar de beweeglijkheid is versneld in aangrenzende regio's, een fenomeen dat niet werd erkend door de vroegere "stopwatch" methode. Andere studies hebben aangetoond dat dysmotiliteit tijdens de actieve fase van de ontsteking kan worden hersteld met remming van COX-2 (Linden et al., 2004)., Maar veranderde motiliteit dat blijft buitende resolutie van de ontsteking is COX-2 ongevoelig (Kräuter et al., 2007).. Bovendien is in deze latere studies, spatiotemporele kaarten gegenereerd door het systeem GIMM onthulde een stapsgewijze patroon van motiliteit die werd waargenomen in post-inflammatoire dieren die bijdraagt aan de verminderde tarieven van de voortstuwing.
Kortom, de cavia distale colon propulsieve motiliteit assay is een high throughput middel van het meten van de effecten van testverbindingen en pathologische condities op motiliteit, Bovendien is het GIMM systeem biedt een eenvoudige en directe benadering van de colon propulsieve motiliteit te beoordelen in vitro. Het zorgt voor continue metingen van de pellet voortstuwing, evenals het genereren van spatio-temporele kaarten om spontane activiteit te bestuderen. In vergelijking met traditionele methoden, het kan ook leiden tot meer complex verschijnsel dat kan worden gekwantificeerd en opnieuw geanalyseerd op verschillende manieren als digitale bestanden worden opgeslagen op het systeem en zijn gemakkelijk bereikbaar.
Disclosures
De productie van deze video werd gesponsord door Catamount Research and Development, Inc, die het instrument gebruikt in dit artikel oplevert.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Krebs’ Solution | ||||
| Isoflurane | Anesthesia | Webster Veterinary | ||
| Epoxy-coated fecal pellet | native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated | |||
| Forceps | Fine Science Tools | |||
| Micro Scissors | Fine Science Tools | |||
| Stainless Steel Pins | ||||
| Beakers | 500 mL | |||
| Gas Tank | 95% O2/5% CO2 | |||
| Timer | ||||
| Gastrointestinal Motility Monitor | Catamount Research and Development | http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm |
References
- Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. J of Physiol (Lond). 24, 99-143 Forthcoming.
- Dickson, E. J., Spencer, N. J., Hennig, G. W., Bayguinov, P. O., Ren, J., Heredia, D. J., Smith, T. K. An enteric occult reflex underlies accommodation and slow transit in the distal large bowel. Gastroenterology. 132, 1912-1924 (2007).
- Foxx-Orenstein, A. E., Jin, J. G., Grider, J. R. 5-HT4 receptor agonists and delta-opioid receptor antagonists act synergistically to stimulate colonic propulsion. Am J Physiol. 275, 979-983 (1998).
- Grider, J. R., Foxx-Orenstein, A. E., Jin, J. G. 5-Hydroxytryptamine4 receptor agonists initiate the peristaltic reflex in human, rat, and guinea pig intestine. Gastroenterology. 115, 370-380 (1998).
- Kadowaki, M., Wade, P. R., Gershon, Participation of 5-HT3, 5-HT4, and nicotinic receptors in the peristaltic reflex of guinea pig distal colon. Am J Physiol. 271, 849-857 (1996).
- Krauter, E. M., Strong, D. S., Brooks, E. M., Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Changes in colonic motility and the electrophysiological properties of myenteric neurons persist following recovery from trinitrobenzene sulfonic acid colitis in the guinea pig. Neurogastroenterol Motil. 19, 990-1000 (2007).
- Langley, J. N. The Autonomic Nervous System. , Heffer. Cambridge, UK. (1921).
- Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea-pig distal colon. J Physiol. 547, 589-601 (2003).
- Linden, D. R., Sharkey, K. A., Ho, W., Mawe, G. M. Cyclooxygenase-2 contributes to dysmotility and enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea pig distal colon. J Physiol. 557, 191-205 (2004).
- Linden, D. R., Chen, J. X., Gershon, M. D., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Serotonin availability is increased in mucosa of guinea pigs with TNBS-induced colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 285, 207-216 (2003).
- Linden, D. R., Couvrette, J. M., Ciolino, A., McQuoid, C., Blaszyk, H., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Indiscriminate loss of myenteric neurones in the TNBS-inflamed guinea-pig distal colon. Neurogastroenterol Motil. 17, 751-760 (2005).
- Lomax, A. E., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. Synaptic facilitation and enhanced neuronal excitability in the submucosal plexus during experimental colitis in guinea-pig. J Physiol. 564, 863-875 (2005).
- Lomax, A. E., O'Hara, J. R., Hyland, N. P., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. Persistent alterations to enteric neural signaling in the guinea pig colon following the resolution of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, 482-491 (2007).
- Strong, D. S., Cornbrooks, C. F., Roberts, J. A., Hoffman, J. M., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Purinergic neuromuscular transmission is selectively attenuated in ulcerated regions of inflamed guinea pig distal colon. J Physiol. 588, 847-859 (2010).
- Wade, P. R., Chen, J., Jaffe, B., Kassem, I. S., Blakely, R. D., Gershon, Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16, 2352-2364 (1996).
- Wood, M. J., Hyman, N. H., Mawe, G. M. The Effects of Daikenchuto (DKT) on Propulsive Motility in the Colon. J Surg Res. , (2009).
