Summary
Utvärdering av kolon motilitet hos marsvin distala kolon med gastrointestinal motilitet Monitor (GIMM) är en okomplicerad och enkel att lära sig metoden för att kvantitativt utvärdera propulsiva motilitet i mag-tarmkanalen.
Abstract
Den gastrointestinal motilitet Monitor (GIMM, Catamount forskning och utveckling, St Albans, VT) är ett in vitro-system som övervakar framåtdrivande motilitet i isolerade delar av marsvin distala kolon. Det kompletta systemet består av en dator, videokamera, belyst orgel bad, peristaltiska och uppvärmda vattenbad cirkulationspumpar, och anpassade GIMM programvara för att spela in och analysera data. Jämfört med traditionella metoder för övervakning kolon peristaltiken, ger GIMM system för kontinuerlig, kvantitativ bedömning av motilitet. Den marsvin distala kolon badar i uppvärmd, syresatt Krebs lösning och avföring pellets in i den muntliga slut drivs längs segmentet av tjocktarmen med en hastighet av ca 2 mm / sek. Filmer av fekal pellets fortsätter längs segmentet fångas och GIMM programvara kan användas följa utvecklingen av fekal pelleten. Priser för framåtdrivande motilitet kan erhållas för hela segmentet, eller för någon särskild region av intresse. Förutom analys av bolus-inducerad motilitet mönster kan Spatiotemporal kartor byggas från video som segment för att bedöma spontana mönster motorisk aktivitet. Tillämpningar av detta system inkluderar farmakologisk utvärdering av effekterna av receptor-agonister och antagonister på framåtdrivande motiliteten, liksom bedömningen av förändringar som är resultatet av patofysiologiska förhållanden, såsom inflammation eller stress. Den marsvin distala kolon framåtdrivande motilitet analys, med hjälp av GIMM systemet är okomplicerat och enkelt att lära sig, och det ger en pålitlig och reproducerbar metod för att bedöma framdrivande motilitet.
Protocol
1. Beredning av Colon Mjukpapper för GIMM
- Att förbereda ett segment av distala kolon för gastrointestinal motilitet Monitor (GIMM), första plats den isolerade kolon i iskallt Krebs lösning (121 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl 2, 25 mm NaHCO 3 , 1,2 mm NaH 2 PO 4, och 8 mm glukos, kolsyrat med 95% O 2 / 5% CO 2). Rensa bort återstående tarmkäxet från ytterväggen och gör ett litet snitt i den muntliga slut så det kan urskiljas när den placeras in i orgeln bad. Obs: vävnad kan stanna i iskallt Krebs lösning för upp till två timmar före experiment.
- Därefter placera in-och utflöden conduits i orgeln badet så de är utanför kamerans fältet för att förhindra störningar i bilden förvärvet. Kontinuerligt BEGJUTA orgeln bad med uppvärmd (37 ° C) syresatt (95%, 5% CO 2) Krebs lösning vid en flödeshastighet på 10 ml / min.
- Att hålla reda på den muntliga vs anal slutar, stift ett segment av distala kolon (minst 5 cm) på vardera änden i orgeln badet, vilket gör att en liten grad av slapphet så att segmentet kan röra sig fritt upp till 1 cm på mitten . Den orala änden ska placeras mot forskare för att underlätta placering av fekal pelleten. Kolon segment bör nålas på samma sätt av samma forskare för varje experiment inom en viss uppsättning av experiment eftersom längden och spänningen av segmentet påverkar graden av framdrivande motilitet, med längsgående sträck minskar graden av transitering (Dickson et al. , 2007).
- Låt förberedelse till jämvikt i minst 30 min.
2. Ställa in GIMM och datainsamling
- I GIMM systemet är kolon segmentet i perfusionen kammaren belysta underifrån. En digital videokamera ansluten till en dator är placerad ovanför kammaren. Kontrollera att både ljus belysning källa och GIMM programvara är påslagna.
- När du har installerat ett nytt experiment i GIMM program, börjar den första rättegången genom att sätta in en epoxibelagd fekal pelleten i den muntliga slutet av kolon segmentet att inleda peristaltiken. Klicka på kameran vippströmbrytare på datorn för att slå på kameran och klicka på inspelningsknappen för att starta inspelningen. Förflyttning av pellets i anal riktning registreras av videokamera och digitala filmer lagras på en PC för senare analys. När pellets har nått slutet av kolon-segmentet, klicka på inspelningsknappen för att stoppa inspelningen.
- För att få en kontroll värde för graden av framdrivning, börja med ett kolon segment från ett friskt djur och utan att tillämpa droger. Genomför 3-5 försök i en enda beredning, med en återhämtning under 5 min mellan varje körning.
- För att avgöra effekterna av vissa villkor eller droger på motilitet i kolon, utföra 3-5 försök / förberedelse för varje experimentell skick. Dessutom utför varje experiment på minst fem olika kolon från minst fem olika djur.
- I analysen av digitala filmer, är graden av fekal pellets framdrivning beräknas som den tid det tar för en pellets att korsa X cm av kolon segmentet.
3. Konstruktion av Spatiotemporal Kartor
- Den digitala videofilmer förvärvats från enskilda GIMM körningar kan konverteras till Spatiotemporal kartor med hjälp av den anpassade GIMM programvara.
- På den horisontella axeln, förändringar i kolon diameter plottas över tid genom att konvertera bilden av kolon i varje bildruta till en silhuett, och beräkna och omvandla diameter längs hela längden i gråskala. Slutresultatet är att pellets och områden för avkoppling vara svart, medan områden av kontraktion visas vitt.
- Den sträcka som pelleten genom tjocktarmen segmentet är representerad på den vertikala axeln.
4. Representant Spatiotemporal Kartor
- Som visas här är representativa Spatiotemporal kartor som visar pellets motilitet i kolon segment under olika experimentella förhållanden. Y (vertikal) axeln representerar pellets ställning över tiden, medan x-(vågrät) axeln representerar avståndet som kulan gått genom tjocktarmen segmentet.
- I Spatiotemporal karta från en kontroll kolon (obehandlad, normal), kommer pelleten framsteg linjärt med en hastighet på ~ 2 mm / sek. Däremot kan administrering av vissa läkemedel eller inflammation i tjocktarmen resultera i störd motilitet mönster som stannade motilitet och blockeras motilitet.
- Resultat från GIMM kan också visas som diagram, där y-axeln visar avståndet i millimeter reste med en fekal pellet och x-axeln representerar tiden i sekunder. Till exempel administration av DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5), enopiat μ-receptoragonist, orsakar en minskning av framdrivande motiliteten i tjocktarmen.
Discussion
Nerv-medierad propulsiv motilitet i mag-tarmkanalen beskrevs första gången mer än ett sekel sedan av Bayliss och Starling (Bayliss och Starling, 1899). Denna iakttagelse ledde till utnämningen av nerver i tarmen som det enteriska nervsystemet (ENS), en tydlig uppdelning av det autonoma nervsystemet (Langley, 1921). Neurogen tarmperistaltik innebär sträcka och / eller slemhinna stimulering vid en given punkt och reflex medieras sammandragningar ovan, eller muntligt till graden av stimulans och avkoppling i aboral riktning. Resultatet är uppkomsten av en tryckgradient som driver luminala innehållet i ett muntligt till aboral riktning. I den lilla tarmen av olika arter och hos råtta tjocktarmen kan peristaltiska vågor av sammandragningar aktiveras genom infusion av vätska in i lumen av segment av tarmen. I marsvin distala kolon kan naturligt eller konstgjort fekal pellets sättas in i muntliga slutet av tjocktarmen och deras framsteg på den del av tjocktarmen kan lätt övervakas. Således ger marsvin distala kolon en enkel och användbar analys för att undersöka framdrivande motilitet i tarmen.
Peristaltiken är en komplex neural reflex som innebär att ett antal neuroactive föreningar och receptorer. Som ett resultat av föreningar som påverkar neurotransmissionen i ENS påverkar graden av framdrivande motilitet. Serotonin, som huvudsakligen frigörs från enterochromaffin celler i tarmslemhinnan, är involverad i inledandet av peristaltiska reflex. Använda marsvin distala kolon, Grider och kollegor visade att propulsiva motiliteten förstärks av intralumenal administrering av 5-HT-4-receptoragonister (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Grider et al, 1998), medan bad med tillämpning av 5 -HT 3 och 5-HT 4-antagonister minskar graden av framdrivning (Kadowaki et al, 1996;. Linden et al, 2003b.). Dessutom ökar hämning av serotonintransportören med serotonin selektiva serotoninåterupptagshämmare (SSRI) peristaltiken vid låga halter, men minskar peristaltiken i högre koncentrationer, troligen beroende på hyposensibilisering av 5-HT receptorer (Kadowaki et al, 1996;.. Wade et al, 1996). Andra signalmolekyler som bidrar till marsvin framåtdrivande motilitet ingår acetylkolin som verkar på nikotinreceptorer, som är den främsta förmedlaren av interneuronal signalering i tarmarna. Blockering synaptisk transmission med nikotinsyra receptorantagonist hexamethonium minskar pellets framdrivning vid höga koncentrationer, medan mindre koncentrationer inte påverkar graden av framdrivning (Kadowaki et al., 1996). Opiater och opioidagonister receptorn, som länge varit kända för att ha hämmande effekter på den gastrointestinala motiliteten, minskad pellets framdrivning hos marsvin propulsiv motilitet modell (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Wood et al, 2009). Intressant, minskar daikenchuto, ett traditionellt japanskt växtbaserade läkemedel som används kliniskt för att behandla kräkningar, magont och oordnat motilitet, graden av pellets framdrivning när det administreras med opioidantagonisten naloxon, och givet enbart resulterar i omvänd peristaltiken (Wood et al. 2009). Dessa resultat illustrerar nyttan av marsvin propulsiv motilitet modell för att bedöma bidragen från olika föreningar och deras receptorer på motilitet i kolon mönster.
Ett antal studier har visat att inflammation leder till förändringar i de elektriska och synaptic egenskaper kolon nervceller (Linden et al, 2003a;.. Lomax et al, 2005), och att dessa förändringar kan kvarstå i veckor efter återhämtning från inflammation (Krauter . et al, 2007; Lomax et al, 2007).. Effekterna av kolit-inducerad neuroplastic förändringar på framåtdrivande motilitet kan undersökas hos marsvin distala kolon med GIMM systemet. Detta system har flera fördelar jämfört med den traditionella metoden för övervakning motilitet i kolon, som bedömer framdrivande rörlighet genom att helt enkelt mäta tiden en fekal pellets färdas ett visst avstånd. Tidigare studier av inflammation-inducerad neurala plasticitet i tjocktarmen har antytt att det är en minskning av hastigheten på pellets framdrivning (Linden et al, 2003a;.. Linden et al, 2005), men nyare undersökningar med hjälp av GIMM systemet har visat mer komplexa förändringar (Stark et al., 2010). Till exempel är andelen pellets framdrivning minskade i såriga regioner i den inflammerade distala kolon, men motilitet accelereras i angränsande regioner, ett fenomen som inte erkändes av den tidigare "stoppur" metoden. Andra studier har visat att dysmotilitet under den aktiva fasen av inflammationen kan återställas med en hämning av COX-2 (Linden et al., 2004), men förändrad motilitet som kvarstår efterupplösningen av inflammation är COX-2-okänsliga (Krauter et al., 2007). Dessutom i dessa senare studier visade Spatiotemporal kartor som genereras av GIMM systemet stegvis mönster av motilitet i kolon som observerades i post-inflammatoriska djur som bidrar till minskade andelen framdrivning.
Sammanfattningsvis representerar marsvin distala kolon framåtdrivande motilitet analysen en hög genomströmning sätt att mäta effekterna av test föreningar och patologiska förhållanden på motilitet i kolon, dessutom ger GIMM systemet en enkel och okomplicerad metod för att bedöma kolon framåtdrivande motilitet in vitro. Det möjliggör kontinuerliga mätningar av pellets framdrivning, samt generering av Spatiotemporal kartor för att studera spontan aktivitet mönster. Jämfört med traditionella metoder, kan den ge även mer komplexa fenomen som kan kvantifieras och analyseras flera sätt som digitala filer sparas i systemet och är lätt åtkomliga.
Disclosures
Produktionen av denna video var sponsrad av Catamount forskning och utveckling, Inc, som producerar det instrument som används i denna artikel.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Krebs’ Solution | ||||
| Isoflurane | Anesthesia | Webster Veterinary | ||
| Epoxy-coated fecal pellet | native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated | |||
| Forceps | Fine Science Tools | |||
| Micro Scissors | Fine Science Tools | |||
| Stainless Steel Pins | ||||
| Beakers | 500 mL | |||
| Gas Tank | 95% O2/5% CO2 | |||
| Timer | ||||
| Gastrointestinal Motility Monitor | Catamount Research and Development | http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm |
References
- Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. J of Physiol (Lond). 24, 99-143 Forthcoming.
- Dickson, E. J., Spencer, N. J., Hennig, G. W., Bayguinov, P. O., Ren, J., Heredia, D. J., Smith, T. K. An enteric occult reflex underlies accommodation and slow transit in the distal large bowel. Gastroenterology. 132, 1912-1924 (2007).
- Foxx-Orenstein, A. E., Jin, J. G., Grider, J. R. 5-HT4 receptor agonists and delta-opioid receptor antagonists act synergistically to stimulate colonic propulsion. Am J Physiol. 275, 979-983 (1998).
- Grider, J. R., Foxx-Orenstein, A. E., Jin, J. G. 5-Hydroxytryptamine4 receptor agonists initiate the peristaltic reflex in human, rat, and guinea pig intestine. Gastroenterology. 115, 370-380 (1998).
- Kadowaki, M., Wade, P. R., Gershon, Participation of 5-HT3, 5-HT4, and nicotinic receptors in the peristaltic reflex of guinea pig distal colon. Am J Physiol. 271, 849-857 (1996).
- Krauter, E. M., Strong, D. S., Brooks, E. M., Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Changes in colonic motility and the electrophysiological properties of myenteric neurons persist following recovery from trinitrobenzene sulfonic acid colitis in the guinea pig. Neurogastroenterol Motil. 19, 990-1000 (2007).
- Langley, J. N. The Autonomic Nervous System. , Heffer. Cambridge, UK. (1921).
- Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea-pig distal colon. J Physiol. 547, 589-601 (2003).
- Linden, D. R., Sharkey, K. A., Ho, W., Mawe, G. M. Cyclooxygenase-2 contributes to dysmotility and enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea pig distal colon. J Physiol. 557, 191-205 (2004).
- Linden, D. R., Chen, J. X., Gershon, M. D., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Serotonin availability is increased in mucosa of guinea pigs with TNBS-induced colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 285, 207-216 (2003).
- Linden, D. R., Couvrette, J. M., Ciolino, A., McQuoid, C., Blaszyk, H., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Indiscriminate loss of myenteric neurones in the TNBS-inflamed guinea-pig distal colon. Neurogastroenterol Motil. 17, 751-760 (2005).
- Lomax, A. E., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. Synaptic facilitation and enhanced neuronal excitability in the submucosal plexus during experimental colitis in guinea-pig. J Physiol. 564, 863-875 (2005).
- Lomax, A. E., O'Hara, J. R., Hyland, N. P., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. Persistent alterations to enteric neural signaling in the guinea pig colon following the resolution of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, 482-491 (2007).
- Strong, D. S., Cornbrooks, C. F., Roberts, J. A., Hoffman, J. M., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Purinergic neuromuscular transmission is selectively attenuated in ulcerated regions of inflamed guinea pig distal colon. J Physiol. 588, 847-859 (2010).
- Wade, P. R., Chen, J., Jaffe, B., Kassem, I. S., Blakely, R. D., Gershon, Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16, 2352-2364 (1996).
- Wood, M. J., Hyman, N. H., Mawe, G. M. The Effects of Daikenchuto (DKT) on Propulsive Motility in the Colon. J Surg Res. , (2009).
