Summary
Valutazione della motilità del colon nel colon distale cavia con il monitor Motilità Gastrointestinale (Gimm) è un approccio diretto e semplice per imparare a valutare quantitativamente motilità propulsiva nel tratto gastrointestinale.
Abstract
Il monitor Motilità Gastrointestinale (Gimm; Catamount Ricerca e Sviluppo; St. Albans, VT) è un sistema in vitro che controlla la motilità propulsiva nei segmenti isolati di cavia del colon distale. Il sistema completo è costituito da un computer, video camera, bagno organo illuminato, bagno d'acqua riscaldata peristaltica e pompe di circolazione, e personalizzati Gimm software per registrare e analizzare i dati. Rispetto ai metodi tradizionali di monitoraggio peristalsi del colon, il sistema Gimm permette di continuo, la valutazione quantitativa della motilità. Il colon distale cavia è immersa nella riscaldato, soluzione ossigenata di Krebs, e pellets fecali inserito alla fine orale sono spinti lungo il segmento di due punti a una velocità di circa 2 mm / sec. Film del procedimento fecale pellet lungo il segmento vengono catturati, e il software può essere utilizzato Gimm monitorare l'avanzamento dei pellet fecali. Tassi di motilità propulsiva può essere ottenuto per l'intero segmento e per ogni regione di particolare interesse. Oltre all'analisi del bolo indotta modelli di motilità, mappe spazio-temporali possono essere costruiti da segmenti di video catturato a valutare modelli di attività motoria spontanea. Le applicazioni di questo sistema di includere la valutazione farmacologica degli effetti di agonisti ed antagonisti dei recettori sulla motilità propulsiva, così come la valutazione dei cambiamenti che derivano da condizioni fisiopatologiche, come infiammazioni o stress. La cavia del colon distale motilità propulsiva test, utilizzando il sistema Gimm, è immediato e semplice da imparare, e fornisce un metodo affidabile e riproducibile per valutare la motilità propulsiva.
Protocol
1. Preparazione del tessuto Colon per Gimm
- Per preparare un segmento del colon distale per il monitor Motilità Gastrointestinale (Gimm), al primo posto i due punti isolati in ghiacciata soluzione Krebs (121 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl 2, 25 mM NaHCO 3 , 1,2 mM NaH 2 PO 4, e 8 mM glucosio; aerato con il 95% O 2 / 5% di CO 2). Sgombrare il campo da mesentere rimanenti la parete esterna e fare una piccola incisione, alla fine, per via orale in modo che possa essere distinto quando viene inserito nel bagno di organo. Nota: il tessuto può rimanere in ghiacciato soluzione Krebs per un massimo di 2 ore prima sperimentazione.
- Quindi, la posizione dei condotti di afflusso e deflusso nel bagno degli organi in modo che siano al di fuori del campo della telecamera per evitare interferenze con l'acquisizione delle immagini. Continuamente il bagno profumato organo con preriscaldata (37 ° C) ossigenata (95%, 5% CO 2) soluzione Kreb ad un flusso di 10 ml / min.
- Tenere traccia delle estremità orale vs anale, perno di un segmento del colon distale (almeno 5 cm) alle due estremità nel bagno organo, permettendo un piccolo grado di lassità in modo che il segmento può muoversi liberamente fino a 1 cm nel mezzo . La fine orale deve essere posizionato verso il ricercatore per la facilità di collocare la fecale pellet. Segmenti del colon dovrebbero essere riposte nello stesso modo dal ricercatore stesso per ogni esperimento all'interno di un dato insieme di esperimenti perché la lunghezza e la tensione del segmento influisca sul tasso di motilità propulsiva, con tratto longitudinale diminuendo la velocità di transito (Dickson et al. , 2007).
- Permettere al prodotto di equilibrare per almeno 30 min.
2. Impostazione Gimm e acquisizione dati
- Nel sistema Gimm, il segmento del colon nella camera di perfusione è illuminato da sotto. Una videocamera digitale collegata al computer è posizionato sopra la camera. Assicurarsi che sia la fonte di illuminazione luce e software Gimm siano accesi.
- Dopo la creazione di un nuovo esperimento nel software Gimm, iniziare la prima prova inserendo un rivestimento epossidico fecale pellet nel fine orale del segmento del colon per avviare la peristalsi. Fare clic sull'interruttore fotocamera attivare il computer per accendere la fotocamera e fare clic sul pulsante di registrazione per iniziare la registrazione. Il movimento della pallina nella direzione anale è registrato dalla videocamera e il film digitali vengono memorizzate su un PC per una successiva analisi. Quando il pellet ha raggiunto la fine del segmento del colon, fare clic sul pulsante di registrazione per terminare la registrazione.
- Per ottenere un valore di controllo per la velocità di propulsione, iniziare con un segmento del colon da un animale sano e senza applicare la droga. 3-5 sperimentazione condotta in una singola preparazione, con un periodo di recupero di 5 minuti tra ogni esecuzione.
- Per determinare gli effetti di talune condizioni o farmaci sulla motilità del colon, eseguire 3-5 prove / preparato per ogni condizione sperimentale. Inoltre, eseguire ogni esperimento su almeno cinque punti e virgola diversa da almeno cinque diversi animali.
- Nell'analisi dei film digitale, il tasso di fecale propulsione pellet è calcolato come il tempo necessario per una pastiglia per attraversare cm X del segmento di colon.
3. Costruzione di mappe spazio-temporali
- I video digitali acquisite da corre Gimm individuali possono essere convertiti in mappe spazio-temporale utilizzando il software personalizzato Gimm.
- Sull'asse orizzontale, i cambiamenti del diametro del colon sono tracciati nel tempo convertendo l'immagine del colon in ogni fotogramma video per una silhouette, e il calcolo e la conversione del diametro per tutta la lunghezza in scala di grigi. Il risultato finale è che il pellet e le aree di relax appaiono nere, mentre le aree di contrazione appaiono bianche.
- La distanza percorsa dal pellet attraverso il segmento del colon è rappresentato sull'asse verticale.
4. Rappresentante Mappe spazio-temporale
- Qui sono rappresentativi mappe spazio-temporale che mostra motilità pellet in segmenti del colon in varie condizioni sperimentali. L'(verticale) l'asse y rappresenta la posizione di pellet nel corso del tempo, mentre la (orizzontale) x asse rappresenta la distanza che il pellet progredito attraverso il segmento di colon.
- Nella mappa spazio-temporale da due punti di controllo (non trattato, normale), il pellet viene progresso lineare ad una velocità di circa 2 mm / sec. Al contrario, la somministrazione di alcuni farmaci o infiammazione nel colon può causare modelli di motilità perturbato, come la motilità e la motilità fermato ostruito.
- I risultati di Gimm possono anche essere visualizzati come grafici, in cui l'asse y rappresenta la distanza in millimetri percorsa da un fecale pellet e l'asse delle ascisse rappresenta il tempo in secondi. Per esempio, la somministrazione di DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5), unoppiaceo μ-agonista del recettore, provoca una diminuzione della motilità propulsiva nel colon.
Discussion
Nervo-mediata motilità propulsiva nel tratto gastrointestinale è stata descritta la prima volta oltre un secolo fa da Bayliss e Starling (Bayliss e Starling, 1899). Questa osservazione ha portato alla designazione dei nervi dell'intestino come il sistema nervoso enterico (ENS), una divisione distinta del sistema nervoso autonomo (Langley, 1921). Neurogena peristalsi intestinale comporta allungamento e / o la stimolazione della mucosa in un dato punto e contrazioni riflesso mediato di cui sopra, o orale, il livello di stimolo e di relax in direzione aborale. Il risultato è la generazione di un gradiente di pressione che spinge il contenuto luminale in una orale alla direzione aborale. Nell'intestino tenue di una varietà di specie, e nell'intestino grosso ratto, onde peristaltiche delle contrazioni possono essere attivate mediante infusione di fluido nel lume di segmenti di intestino. Nel colon distale cavia, pellet fecali naturale o artificiale può essere inserito nel fine orale del colon e del loro progresso lungo il segmento del colon possono essere facilmente monitorati. Così, il colon distale cavia fornisce un test semplice e utile per lo studio della motilità propulsiva nell'intestino.
Peristalsi è un riflesso complesso neurale che coinvolge un numero di composti neuroattivi e recettori. Di conseguenza, i composti che influenzano la neurotrasmissione nel ENS influenzano il tasso di motilità propulsiva. Serotonina, rilasciata principalmente dalle cellule enterocromaffini della mucosa intestinale, è coinvolto in l'inizio del riflesso peristaltico. Utilizzando il maiale d'India del colon distale, Grider e colleghi hanno dimostrato che la motilità propulsiva è rafforzata dalla somministrazione intralumenal di 5-HT 4 agonisti del recettore (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Grider et al, 1998), mentre il bagno di applicazione su 5 -HT 3 e 5-HT 4 antagonisti dei recettori diminuisce la percentuale di propulsione (Kadowaki et al, 1996;. Linden et al, 2003b).. Inoltre, l'inibizione del trasportatore della serotonina con inibitori selettivi del reuptake della serotonina (SSRIs) aumenta la peristalsi a basse concentrazioni, ma diminuisce la peristalsi a concentrazioni più elevate, probabilmente a causa desensibilizzazione dei recettori 5-HT (Kadowaki et al, 1996;.. Wade et al, 1996). Altre molecole di segnalazione che contribuiscono alla motilità cavia propulsiva comprendono acetilcolina agisce a livello dei recettori nicotinici, che è il mediatore principale della segnalazione interneuronali nell'intestino. Bloccare la trasmissione sinaptica con l'antagonista del recettore nicotinico esametonio diminuisce propulsione a pellet ad alte concentrazioni, mentre minore concentrazione non influenzano il tasso di propulsione (Kadowaki et al., 1996). Oppiacei, e gli agonisti dei recettori oppioidi, che sono da tempo noti per avere effetti inibitori sulla motilità gastrointestinale, la diminuzione di propulsione pellet nel modello motilità cavia propulsiva (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Wood et al, 2009). È interessante notare che daikenchuto, una medicina tradizionale giapponese a base di erbe usato in clinica per il trattamento di vomito, mal di stomaco, e la motilità disordinato, diminuisce la percentuale di propulsione a pellet quando somministrato con il naloxone, antagonista degli oppioidi, e quando somministrato da solo, si traduce in peristalsi inversa (Wood et al. 2009). Questi risultati illustrano l'utilità del modello di motilità propulsiva cavia per valutare i contributi di vari composti e dei loro recettori sui modelli di motilità del colon.
Numerosi studi hanno dimostrato che l'infiammazione porta a cambiamenti nelle proprietà elettriche e sinaptica dei neuroni del colon (Linden et al, 2003a;.. Lomax et al, 2005), e che questi cambiamenti possono persistere per settimane dopo il recupero da infiammazione (Krauter . et al, 2007; Lomax et al, 2007).. L'impatto dei cambiamenti neuroplastici colite indotta sulla motilità propulsiva può essere indagato nel colon distale cavia utilizzando il sistema Gimm. Questo sistema presenta diversi vantaggi rispetto al metodo tradizionale di monitoraggio motilità del colon, che valuta la motilità propulsiva, semplicemente misurando il tempo un fecale pellet viaggia una data distanza. Precedenti studi di infiammazione indotta plasticità neurale nel colon hanno indicato vi è una diminuzione della velocità di pellet di propulsione (Linden et al, 2003a;.. Linden et al, 2005), ma ricerche più recenti utilizzando il sistema Gimm hanno rivelato più modifiche complesse (Forte et al., 2010). Per esempio, il tasso di pellet propulsione è diminuita nelle regioni ulcerate del colon infiammato distale, ma la motilità è accelerato nelle regioni adiacenti, un fenomeno che non è stato riconosciuto da precedenti il metodo del "cronometro". Altri studi hanno dimostrato che dismotilità durante la fase attiva di infiammazione possono essere ripristinati con inibizione della COX-2 (Linden et al., 2004), ma la motilità alterata che persiste oltrela risoluzione di infiammazione è COX-2 insensibile (Krauter et al., 2007). Inoltre, in questi studi successivi, le mappe spazio-temporale generata dal sistema Gimm rivelato un modello graduale della motilità del colon, che è stata osservata in animali post-infiammatoria che contribuisce alla riduzione dei tassi di propulsione.
In conclusione, la cavia del colon distale propulsiva saggio motilità rappresenta un elevato throughput mezzo per misurare gli effetti dei composti di prova e le condizioni patologiche sulla motilità del colon, inoltre, il sistema Gimm fornisce un approccio semplice e diretto per valutare la motilità propulsiva del colon in vitro. Esso consente per le misurazioni continue di pellet di propulsione, così come la generazione di mappe spazio-temporale per studiare gli schemi di attività spontanea. Rispetto ai metodi tradizionali, ma può anche produrre fenomeno più complesso che può essere quantificato e modi rianalizzati multipli come file digitali vengono salvati nel sistema e sono facilmente accessibili.
Disclosures
La produzione di questo video è stato sponsorizzato da Catamount Ricerca e Sviluppo, Inc, che produce lo strumento utilizzato in questo articolo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Krebs’ Solution | ||||
| Isoflurane | Anesthesia | Webster Veterinary | ||
| Epoxy-coated fecal pellet | native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated | |||
| Forceps | Fine Science Tools | |||
| Micro Scissors | Fine Science Tools | |||
| Stainless Steel Pins | ||||
| Beakers | 500 mL | |||
| Gas Tank | 95% O2/5% CO2 | |||
| Timer | ||||
| Gastrointestinal Motility Monitor | Catamount Research and Development | http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm |
References
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