Summary
Этот протокол описывает общий порядок для изучения рекомбинантный рецептор-связывающий домен (РосБР)-вакцины на основе субъединиц против атипичной пневмонии. Она включает в себя методы для трансфекции и экспрессии белка в РосБР 293T клеток, иммунизация мышей с РосБР и обнаружения нейтрализации активности сыворотки мыши использованием установленных pseudovirus ОРВИ нейтрализации анализа.
Abstract
Основываясь на их профиль безопасности и способность вызывать мощный иммунный ответ против инфекций, субъединичные вакцины были использованы в качестве кандидатов на широкий спектр патогенных 1-3. Так как система млекопитающих клетка способна пост-трансляционной модификации, формируя таким образом правильно сложить и гликозилированного белков, рекомбинантных белков выражается в клетках млекопитающих, показали наибольший потенциал для поддержания высокой антигенность и иммуногенность 4-6.
Хотя никаких новых случаев заболевания атипичной пневмонией были зарегистрированы с 2004 года, будущие вспышки являются постоянной угрозой, поэтому разработке вакцин против SARS-коронавирус является разумным шагом превентивных и должны быть выполнены. РосБР белка SARS-коронавирус S играет важную роль в связывании рецептора и индукцию специфичных нейтрализующих антител против вирусных инфекций 7-9. Таким образом, в этом протоколе описываются новые методы для развития РосБР основе субъединицы вакцины против атипичной пневмонии. Короче говоря, рекомбинантный белок RBD (rRBD) была выражена в супернатант культуры клеток млекопитающих 293T клетки для получения правильно сложенным белка с надлежащим конформации и высокой иммуногенностью 6. Трансфекции рекомбинантной плазмиды, кодирующей РосБР для клеток, то выполняется с помощью трансфекции фосфатом кальция методом 6,10 с некоторыми изменениями. По сравнению с методом трансфекции липидного 11,12, это изменение фосфата кальция трансфекции метод дешевле, проще в обращении, и имеет потенциал, чтобы достичь высокой эффективности раз трансфекции комплексе с подходящим размером и формой формируется 13,14. Наконец, нейтрализации ОРВИ pseudovirus анализа был введен в протокол и используется для обнаружения нейтрализующих активность сыворотки мышей, вакцинированных rRBD белка. Этот анализ является относительно безопасным, не связаны с инфекционными SARS-коронавирус, и может быть выполнена без требования биобезопасности-3 лаборатории 15.
Протокол, описанный здесь, может также быть использована для разработки и изучения рекомбинантных вакцин субъединицы против других вирусов с классом я слитые белки, например, ВИЧ-инфекции, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус Эбола, вирус гриппа, а также Нипах и Handra вирусов. Кроме того, методы генерации pseudovirus и впоследствии создание анализа pseudovirus нейтрализация может быть применен ко всем этим вирусам.
Protocol
1. Рекомбинантный SARS-коронавирус РосБР белковый препарат
- Подготовка фосфата кальция трансфекции реагента
- 2X HBS буфера приготовления: Смешать 16 г хлористого натрия, 0,4 г Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, и 13,0 г HEPES. Отрегулируйте рН до 7,00 и воспитывать общий объем до 1000 мл в дистиллированной воде. После фильтрации раствор для стерилизации, аликвоты и хранить его при температуре -20 ° C.
Подсказка: Любые изменения рН повлияет трансфекции результаты. Таким образом, желательно, чтобы проверить несколько значений рН около 7.00 (например, 6,99, 7,00 или 7,01) и найти лучший для трансфекции с использованием метода представлены ниже. - 2,5 М CaCl 2 препарата: Добавить 73,5 г CaCl 2 * 2H 2 O в дистиллированной воде в конечном объеме 200 мл. Фильтры решение и хранить при температуре -20 ° C.
- 2X HBS буфера приготовления: Смешать 16 г хлористого натрия, 0,4 г Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, и 13,0 г HEPES. Отрегулируйте рН до 7,00 и воспитывать общий объем до 1000 мл в дистиллированной воде. После фильтрации раствор для стерилизации, аликвоты и хранить его при температуре -20 ° C.
- Рекомбинантные плазмиды трансфекции и очистки белков
- Сплит 293T клеток на 50-70% слияния 24 часов до трансфекции. Рост клеток в Т-175 см 2 культуре ткани колбы в 40 мл DMEM, содержащей 10% тепла инактивированной (HI) FBS и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S) при 37 ° С в 5% СО 2.
- Все трансфекции реагенты должны быть доведены до комнатной температуры перед трансфекции. Эти реагенты включают 2X HBS, 2,5 CaCl 2, DIH 2 O, и rRBD плазмиды 6.
Подсказка: окончательное рекомбинантной плазмиды построить для экспрессии белка должно содержать сигнальный пептид для обеспечения секреции выразил рекомбинантных белков в культуру супернатанта. 6x теги Его могут быть добавлены в C-терминал выразил белка для легкой очистки. - Подготовьте 50 мл () и один 15 мл (B) BD Сокол трубки, а также добавлять реагенты для труб, как это указано в таблице 1. Добавить 2X HBS буфера в трубке А. В трубке В, добавить 2,5 М CaCl 2 и rRBD плазмиды, и довести объем потребности в DIH 2 O.
Таблица 1. Трансфекция подготовки смеси и объемыА. Один Т-175 см 2 культуре ткани колбу (4000 мкл / флакон): подготовиться к rRBD выражение Труба Труба B 2X HBS 2000 мкл 2,5 М CaCl 2 200 мкл rRBD ДНК плазмиды 40 мкг DIH 2 O в 2000 мкл B. Один 100-мм чашки Петри (1000 мкл / блюдо): подготовить для производства pseudovirus атипичной пневмонии Труба Труба B 2X HBS 500 мкл 2,5 М CaCl 2 50 мкл Плазмиды SARS-коронавирус S ДНК 5 мкг ВИЧ-1-плазмиды (pNL4-3.luc.RE) 5 мкг DIH 2 O в 500 мкл
Объемы перечисленных в таблице 1, для одного трансфекции единицы. Если более колбах или блюда используются для трансфекции, отрегулировать объемы соответственно. - Добавить ДНК-кальциевый раствор в трубке B в трубку в каплям, сохраняя при этом постоянную и нежный перемешивания в вихре. Пусть смесь сидеть при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Ключ для успешной трансфекции фосфатом кальция зависит от размера и формы осадок. Таким образом, смесь следует перемешать постоянно и медленно, чтобы выполнить это требование, и, как результат, повышение эффективности трансфекции.
- Добавить в смесь по каплям и даже образом в клетках 293T (4000 мкл / флакон). Культуры клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С в 5% СО 2.
- Замените культуральной среде со свежей бессывороточной OPTI-MEM я уменьшенного сыворотки среднего (50 мл / флакон) 8-10 ч после трансфекции. Продолжайте культуры клеток в течение еще двух дней в том же состоянии.
- Сбор супернатант, содержащий выразил rRBD белка 72 ч после трансфекции. Центрифуга при 6000 оборотов в минуту в течение 15 минут, чтобы удалить ячейку мусора. Добавить коктейль ингибиторов протеаз, чтобы собранные супернатант и хранить при температуре 4 ° С в течение ночи.
- На следующий день, очищают rRBD рекомбинантного белка из супернатанта культуры, используя инструкции Ni-NTA Superflow следующие производителя.
- Концентрат очищенный белок использованием Amicon Ультра труб -15 концентрации. После концентрации белка,добавить PBS с концентрацией труб и центрифуга снова, чтобы удалить имидазола в элюции буфера. Рассчитайте концентрации белка и хранить очищенный белок при температуре -80 ° С до использования.
2. Иммунизация мышей и взятием проб
- Предварительно теплой Sigma адъювантной системы (SAS) до 40-45 ° С в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте 1 мл PBS на флакон и тщательно перемешать.
- Подготовка белка адъювантной эмульсии в соответствии с протоколом в таблице 2. Внесите рассчитывается rRBD белка в 1,5 мл трубки. Добавить равный объем SAS адъювантной к трубке и вихревые энергично в течение 2-3 мин с образованием эмульсии.
Подсказка: объемы перечисленных в таблице 2 для одной мыши. Отрегулируйте объемах в соответствии с фактической численности мыши используется. Для каждой группы, смешать белки и адъювантной необходимых для каждой вакцины. Всегда готовьте один дополнительный образец для вакцинации для обеспечения точности.
Таблица 2. Мышь иммунизации протоколаГруппа 1-й вакцины
(200 мкл / мышь)2-й вакцины
(200 мкл / мышь)3-й вакцины
(200 мкл / мышь)rRBD белка 20 мкг белка в PBS
(100 мкл) + 100 мкл SAS10 мкг белка в PBS (100 мкл) + 100 мкл SAS 10 мкг белка в PBS (100 мкл) + 100 мкл SAS PBS контроль 100 мкл PBS +
100 мкл SAS100 мкл PBS +
100 мкл SAS100 мкл PBS +
100 мкл SAS - Подкожно премьер-иммунизации женщин BALB / с мышами (4-6 недель, 5 мышей / группу), и увеличить в два раза с rRBD и SAS, как указано в таблице 2. Используйте PBS группе контроля. Сайт для подкожных инъекций обычно выбирают является свободной кожи между лопатками. Кроме того, вентральной брюшной полости обычно используется, потому что это легче внедрить, и может наблюдать любой утечки из места инъекций. При повторных доз вакцины используются, легко выбирать различные сайты инъекции, предотвращая потенциальные местные кожные реакции.
- Bleed мышей через ретроорбитального с анестезией до иммунизации и через 10 дней после каждой вакцинации и сывороток тепла при 56 ° С в течение 30 мин для инактивации комплемента. Магазин мыши сыворотки при температуре -20 ° С до использования.
3. Нейтрализация Обнаружение использованием Пробирной Pseudovirus Нейтрализация
- Подготовка ОРВИ pseudovirus
- Сплит 293T клеток в 100 мм культуре ткани чашках Петри (2х10 6 кл / блюдо) 16 часов до трансфекции, и растут клетки как указано выше.
- Подготовка реагентов трансфекции, как указано в таблице 1. Сотрудничество трансфекции плазмидой, кодирующей SARS-коронавирус S белка и плазмиды, кодирующей ENV-неисправен, люциферазы, экспрессирующих ВИЧ-1 генома (pNL4-3.luc.RE) с помощью фосфата кальция трансфекции реагента.
- Замените среду с 10 мл свежей DMEM, содержащей 10% FBS и 1% P / S 8-10 ч после трансфекции. Сбор супернатант, содержащий ОРВИ pseudovirus 72 ч после трансфекции.
- Фильтры pseudovirus через 0,45 мкм фильтр. Алиготе и хранить при температуре -80 ° С до использования.
- Атипичной пневмонии pseudovirus нейтрализации анализа
- Сплит 293T клеток, экспрессирующих SARS-коронавирус рецепторов ACE2 (ACE2/293T) на 10 4 cells/100 мкл / лунку в 96-луночных культуры тканей 16 ч до заражения.
- Развести ОРВИ pseudovirus по 2-кратный для обнаружения титра вируса в ACE2/293T клеток.
- Серийно разбавленный мыши сывороток в 96-луночных культуре тканей, а также добавить равный объем титруемой pseudovirus атипичной пневмонии. Preincubate пластин при 37 ° С в течение 1 ч.
- После инкубации, добавьте 100 мкл сыворотки-pseudovirus смеси ACE2/293T клеток, и продолжают расти клетки при 37 ° С в 5% СО 2. Добавьте свежие DMEM 24 часов спустя.
- Полностью удалить культуры супернатантов из пластин 72 ч после заражения. Добавить 1X люциферазы культуре клеток лизис реагента (60 мкл / лунку), а также содействовать лизиса клеток с постоянной тряски пластин в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
- Передача клеточных лизатов (50 мкл / лунку) в люминометра пластин (Microfluor 96-луночных планшетах). Добавить люциферазы подложки (50 мкл / лунку), включенных в люциферазы системы анализа и выявления относительной активности люциферазы в Ультра 384 люминометра.
- Рассчитать ОРВИ pseudovirus титр нейтрализации и присутствует в виде 50% нейтрализации титр антител (NT 50) 6.
Discussion
Плотность клеток является важным фактором, влияющим на эффективность фосфата кальция основе трансфекции. По нашему опыту, менее 70% слияния клеток приносит лучшие результаты. Таким образом, для того, чтобы улучшить эффективность трансфекции, рекомендуется, чтобы плотность клеток быть на уровне около 50-70% от слияния. Трансфекции фосфатом кальция метод обычно считается менее эффективным по сравнению с другими методами трансфекции, таких как липидные трансфекции 16. Тем не менее, в этом протоколе, мы использовали модифицированный фосфата кальция трансфекции метод, посредством постоянного и медленно смешивания трансфекции решение в вихрь обеспечивает формирование осадка с соответствующего размера и формы, тем самым повышая эффективность трансфекции.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) в США (RO1 AI68002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Na2HPO4*7H2O | Sigma-Aldrich | S2429 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| OPTI-MEM I Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836170001 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30450 | |
| Sigma adjuvant system | Sigma-Aldrich | S6322 | |
| Luciferase assay system | Promega Corp. | E1501 | |
| Luciferase cell culture lysis reagent (5X) | Promega Corp. | E1531 | |
| Amicon Ultra - 15 | EMD Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor 96-well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7905 | |
| Ultra 384 luminometer | Tecan Group Ltd. |
References
- Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).
- Tait, A., Hall, F. R. Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).
- Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270. Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).
- Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
- Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).
- Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity. Virology. 393, 144-150 (2009).
- Ambrosino, D. M. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).
- Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426, 450-454 (2003).
- He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).
- Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection. Gene. 270, 61-68 (2001).
- Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents. BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).
- Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
- Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, 140-149 (2004).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
