Summary
이 프로토콜은 사스에 대한 재조합 수용체 결합 도메인 (RBD) 기반 subunit 백신을 연구를위한 일반적인 절차를 설명합니다. 그것은 293T 세포에 RBD 단백질, RBD와 설립 사스 pseudovirus의 중화 분석을 사용하여 마우스 세라의 중화 활동의 검출과 생쥐의 예방 접종의 transfection과 표현을위한 방법을 포함하고 있습니다.
Abstract
그들의 안전을 프로필과 감염에 대한 강력한 면역 반응을 유도하는 능력을 기반으로, subunit 백신은 1-3 병원균의 다양한 후보로 사용되었습니다. 포유 동물 세포 시스템이 있으므로 제대로 접힌과 glycosylated 단백질을 형성, 사후 translational 수정이 가능하기 때문에, 포유 동물 세포에 표현 재조합 단백질은 높은 항원성 및 immunogenicity 4-6을 유지하기 위해 가장 큰 잠재력을 보여주었다.
SARS에 대한 새로운 사건이 2004 년 이후보고되지 않고있다지만, 미래 발생은 지속적인 위협하므로, SARS - CoV에 대한 백신의 개발은 신중하게 예방 단계와 진행해야합니다. SARS - CoV S 단백질의 RBD는 수용체 바인딩 및 바이러스 감염에 대한 구체적인 7-9 중화 항체의 유도에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 따라서,이 프로토콜에서 우리는 사스에 대한 RBD 기반 subunit 백신을 개발하기위한 새로운 방법을 설명합니다. 간단히, 재조합 단백질 RBD (rRBD)는 적절한 형태와 높은 immunogenicity 6 제대로 접힌 단백질을 얻기 위해 포유 동물 293T 세포의 문화 뜨는으로 표현되었다. 세포에 재조합 플라스미드 인코딩 RBD의 transfection 그 다음 수정과 칼슘 인산염 transfection 방법 6,10를 사용하여 수행되었습니다. 지질 transfection 방법 11,12 비해,이 수정된 칼슘 인산염 transfection 방법은 처리 저렴, 쉽게하고, 적당한 크기와 모양과 transfection 복합은 13,14을 형성되면 높은 효능을 도달하는 가능성이있다. 마지막으로, 사스 pseudovirus의 중화 분석은 프로토콜의 도입 rRBD 단백질과 예방 접종을 생쥐의 세라의 중화 활동을 탐지하는 데 사용되었다. 이 분석은 상대적으로 안전, 전염병 사스 - CoV를 포함하지 않으며, biosafety - 3 실험실 15 요구하지 않고 수행할 수 있습니다.
프로토콜은 또한 예를 들어, HIV, 호흡 syncytial 바이러스 (RSV), 에볼라 바이러스, 인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 Nipah과 Handra 바이러스를 설계하고 클래스 I 융합 단백질로 다른 바이러스에 대한 재조합 subunit 백신을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 여기에 설명되어 있습니다. 또한, pseudovirus을 생성하고 이후 pseudovirus의 중화 분석 수립을위한 방법은 모든 바이러스에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 재조합 SARS - CoV RBD 단백질 준비
- 칼슘 인산염 transfection 시약 준비
- 2X HBS 버퍼 준비 : 함께 NaCl의 16g, 나 2 HPO 4 * 7H 2 O의 0.4 g, 그리고 HEPES의 13.0 g를 섞습니다. 7.00로 산도를 조절하고 증류수 1000 ML에 총 볼륨을 가져 오십시오. 살균, 나누어지는에 대한 솔루션을 필터링 및 -20 ° C.에서 저장 후
힌트 : 산도 가치의 모든 변동은 transfection 결과에 영향을 미치지합니다. 따라서 그것은 7.00 (예를 들어, 6.99, 7.00, 또는 7.01) 주위 여러 산도 값을 테스트하고 아래에 소개된 방법을 사용하여 transfection에 가장 적합한 하나를 찾을 것을 권장합니다. - 2.5 M CaCl 2 준비 : 200 ML의 최종 볼륨 증류수에 CaCl 2 * 2 시간 2 O의 73.5 g을 추가합니다. -20 ° C.에 솔루션 및 상점 필터
- 2X HBS 버퍼 준비 : 함께 NaCl의 16g, 나 2 HPO 4 * 7H 2 O의 0.4 g, 그리고 HEPES의 13.0 g를 섞습니다. 7.00로 산도를 조절하고 증류수 1000 ML에 총 볼륨을 가져 오십시오. 살균, 나누어지는에 대한 솔루션을 필터링 및 -20 ° C.에서 저장 후
- 재조합 플라스미드 transfection하여 단백질 정화
- transfection 전에 confluency 24 H는 50~70%에서 293T 세포 분할. 40 ML DMEM는 FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S) 37 10 % 열 inactivated (HI)를 포함 ° C를 5% CO 2의 T - 175cm 두 조직 문화 flasks에 세포를 성장.
- 모든 transfection의 시약은 transfection 전에 상온까지 가지고 있어야합니다. 이 시약은 2X HBS, 2.5M CaCl 2, DiH 2 O, 그리고 rRBD 플라스미드 6 포함되어 있습니다.
힌트 : 단백질 표정은 문화 뜨는로 표현 재조합 단백질의 분비를 보장하기 위해 신호 펩티드를 포함해야합니다에 대한 최종 재조합 플라스미드를 사용 제작합니다. 배의 그의 태그는 쉽게 정화를위한 표현 단백질의 C - 터미널에 추가할 수 있습니다. - 한 50 ML (A) 한 15 ML (B) BD 팰컨 튜브를 준비하고, 같은 표 1에 표시된 튜브에 시약을 추가합니다. 튜브 B에 관 A.에 2X HBS 버퍼를 추가 2.5M CaCl 2를 추가하고 플라스미드 rRBD, 그리고 DiH 2 O.의 요구 사항에 볼륨을 가지고
표 1. Transfection 혼합물의 준비와 볼륨A. 하나의 T - 175cm 두 조직 문화 플라스크 (4000 μL / 술병) : rRBD 표현을위한 준비 튜브 튜브 B 2X HBS 2000 μL 2.5M CaCl 2 200 μL rRBD 플라스미드 DNA 40 μg DiH 2 O로 2000 μL B. 하나의 100 - mm 배양 접시 (1000 μL / 접시) : 사스 pseudovirus 생산을위한 준비 튜브 튜브 B 2X HBS 500 μL 2.5M CaCl 2 50 μL SARS - CoV S 플라스미드 DNA 5 μg (pNL4 - 3.luc.RE) HIV - 1 플라스미드 5 μg DiH 2 O로 500 μL
표 1에 나열된 볼륨 하나 transfection 유닛위한 것입니다. 더 flasks이나 요리가 transfection에 사용하는 경우 적절하게 볼륨을 조절할 수 있습니다. - 와동에 지속적인 부드러운가 혼합 유지하면서, 튜브 dropwise 방식에 관 B의 DNA - 칼슘 솔루션을 추가합니다. 혼합물은 20-30 분 실온에서 앉아 보자. 성공적인 칼슘 인산염 transfection에 대한 열쇠는 형성 촉진의 크기와 모양에 따라 달라집니다. 따라서 혼합물은 그 결과로 transfection의 효능을 향상시키고,이 요건을 충족하기 위해 지속적으로 천천히 vortexed하고 있어야합니다.
- 293T 세포 (4000 μL / 플라스크)에도 dropwise와 방식으로 혼합을 추가합니다. 37 인큐베이터 문화 전지 ° 5% CO 2에서 C.
- 신선한 혈청이없는 OPTI - 멤 I 감소 - 세럼 중간 (50 ML / 술병) 80-10 H 게시할 - transfection있는 문화 매체를 교체합니다. 같은 조건으로 이틀 더 문화 세포로 진행합니다.
- 뜨는 포함하는 표현 rRBD 단백질 72 H 포스트 - transfection를 수집합니다. 세포 파편을 제거 15 분 6,000 rpm으로 원심 분리기. 4 ° C 하룻밤에 수집된 뜨는 및 저장 프로 테아제 억제제 칵테일을 추가합니다.
- 다음날, 니켈 - NTA의 Superflow 다음과 같은 제조 업체의 지침을 사용하여 문화 뜨는에서 rRBD 재조합 단백질 정화.
- Amicon 울트라 -15 농도 튜브를 사용하여 단백질을 정화 집중. 단백질 농도 후,농도 튜브에 PBS를 추가하고 용출 버퍼에 이미다졸을 제거하는 다시 원심 분리기. ° C를 사용하기 전까지 -80에서 단백질을 정제 단백질 농도 및 저장을 계산합니다.
2. 마우스 예방 접종 및 샘플 수집
- 40-45 사전 따뜻한 시그마 도움이되는 시스템 (SAS) ° C 제조 업체의 지시에 따라. 유리병 당 1 ML PBS를 추가하고 철저히 섞는다.
- 표 2의 프로토콜에 따라 도움이되는 단백질의 감광 유제를 준비합니다. 피펫은 1.5 ML 튜브에 rRBD 단백질을 풀었다. 튜브 및 유제를 형성하기 위해 2-3 분 적극적으로 와동에 SAS 도움이되는 동등한 볼륨을 추가합니다.
힌트 : 표 2에 나열된 볼륨 한 마우스입니다. 사용되는 실제 마우스 번호에 따라 볼륨을 조정합니다. 각 그룹에 대한 각 백신에 필요한 단백질과 도움이되는 함께 섞는다. 항상 정확성을 보장하기 위해 예방 접종을 한 여분의 샘플을 준비합니다.
표 2. 마우스 예방 접종 프로토콜그룹 1 일 백신
(200 μL / 마우스)2 차 예방 접종
(200 μL / 마우스)제 3 백신
(200 μL / 마우스)rRBD 단백질 PBS 20 μg 단백질
(100 μL) + 100 μL SASPBS 10 μg의 단백질 (100 μL) + 100 μL SAS PBS 10 μg의 단백질 (100 μL) + 100 μL SAS PBS 제어 100 μL PBS +
100 μL SAS100 μL PBS +
100 μL SAS100 μL PBS +
100 μL SAS - Subcutaneously 프라임 - 면역 여성 BALB / C 마우스 (오래된 4-6주, 5 마우스 / 그룹) 및 rRBD 및 SAS와 배 향상은 표 2에서 지적했다. 컨트롤로 PBS 그룹을 사용합니다. 일반적으로 선택한 피하 주사에 대한 사이트는 양어깨 사이의 느슨한 피부이다. 또는 복부 복부는 그것이 주사 쉽게되기 때문에 일반적으로 사용되며, 사출 사이트에서 어떠한 누수를 관찰 수 있습니다. 백신의 반복 복용을 사용하는 경우, 그것은 잠재적인 지역의 피부 반응을 방지, 각종 사출 사이트를 선택 쉽습니다.
- ° C 30 분 보완을 inactivate하는 56 각 예방 접종 후 예방 접종을 10 일 전에 마취와 함께 복고풍 - 궤도 및 열을 세라를 통해 쥐를 출혈. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관 마우스 세라.
3. Pseudovirus의 중화 분석을 사용하여 중화 감지
- 사스 pseudovirus 준비
- transfection 전에 (2x10 6 셀 / 요리) 100mm 조직 문화를 배양 접시에서 16 H를 293T 세포를 분리하고, 상기 세포를 성장.
- 로 표 1에 표시된 transfection의 시약을 준비합니다. 공동 transfect 플라스미드 인코딩 SARS - CoV S 단백질과 플라스미드 인코딩 환경을 - 결함, 루시페라제 - 표현 HIV - 1 유전자 (pNL4 - 3.luc.RE) 칼슘 인산염 transfection 시약을 사용합니다.
- 10 ML 신선한 DMEM 10 % FBS, 1 % P / S 80-10 H 포스트 transfection을 포함와 매체를 대체합니다. 뜨는 포함 사스 pseudovirus 72 H 포스트 - transfection를 수집합니다.
- 0.45 μm의 필터를 통해 필터 pseudovirus. -80에서 나누어지는하고 저장 ° C까지 사용.
- 사스 pseudovirus의 중화 분석
- 16 H 감염 전에 96 잘 조직 배양 플레이트 4 cells/100 μL / 음 10 SARS - CoV 수용체 ACE2 (ACE2/293T)를 표현 293T 세포를 분할.
- ACE2/293T 세포에서 바이러스 titer를 감지 2 배로 사스 pseudovirus을 희석.
- 순차적으로 96 - 웰 조직 문화 접시에 마우스 세라를 희석하고, titrated 사스 pseudovirus 동등한 볼륨을 추가합니다. 1 H.위한 37 ° C에서 접시를 Preincubate
- 부화 후, ACE2/293T 세포에 세라 - pseudovirus 혼합물 100 μL를 추가하고, 37 세포의 성장을 계속 ° C를 5% CO 2인치 나중에 신선한 DMEM 24 H를 추가합니다.
- 완전히 문화 supernatants는 접시에서 72 H 게시 - 감염을 제거합니다. 1X 루시페라제 세포 배양 용해 시약 (물론 60 μL /)를 추가하고 지속은 실온에서 1-2 H에 대한 번호판을 잡고 세포 용해를 촉진.
- luminometer 플레이트로 전송 세포 lysates (물론 50 μL /) (Microfluor 96 - 웰 플레이트). 루시페라제 분석 시스템에 포함된 루시페라제 기판 (50 μL / 음) 추가하고 울트라 384 luminometer에서 상대 루시페라제 활동을 감지합니다.
- 50% 중화 항체 titer (NT 50) 6 등 사스 pseudovirus의 중화 titer와 선물을 계산합니다.
Discussion
세포 밀도는 칼슘 인산염 기반 transfection의 효능에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 우리의 경험에서 세포의 confluency 미만 70 % 최상의 결과를 제공합니다. 따라서, transfection 효율을 개선하기 위해, 그것은 세포 밀도가 confluency의 50-70 % 정도에서 보관하는 것이 좋습니다. 칼슘 인산염 transfection 방법은 일반적으로 지질 transfection 16 같은 다른 transfection 방식에 비해 덜 효율적인 것으로 생각됩니다. 그러나,이 프로토콜에서 우리는 따라서 transfection 효율을 향상, 소용돌이에 transfection 솔루션의 혼합 지속과 느린 해당 크기와 모양과 침전물의 형성을 보장 의하여 수정된 칼슘 인산염 transfection 방법을 사용합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 국립 보건원 (NIH) (RO1 AI68002)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Na2HPO4*7H2O | Sigma-Aldrich | S2429 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| OPTI-MEM I Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836170001 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30450 | |
| Sigma adjuvant system | Sigma-Aldrich | S6322 | |
| Luciferase assay system | Promega Corp. | E1501 | |
| Luciferase cell culture lysis reagent (5X) | Promega Corp. | E1531 | |
| Amicon Ultra - 15 | EMD Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor 96-well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7905 | |
| Ultra 384 luminometer | Tecan Group Ltd. |
References
- Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).
- Tait, A., Hall, F. R. Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).
- Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270. Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).
- Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
- Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).
- Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity. Virology. 393, 144-150 (2009).
- Ambrosino, D. M. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).
- Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426, 450-454 (2003).
- He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).
- Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection. Gene. 270, 61-68 (2001).
- Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents. BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).
- Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
- Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, 140-149 (2004).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
