Dissection of Human Glaskörper Elemente für Proteomanalyse

Summary

Dieses Video zeigt eine effektive Technik zur Differenzierung und seziert die verschiedenen semi-transparente Strukturen des menschlichen Glaskörper in post mortem Augen.

Abstract

Der Glaskörper ist eine optisch klare kollagenen extrazellulären Matrix, die das Innere des Auges und liegt über der Netzhaut füllt. ^1,2 Abnormal Interaktionen zwischen Glaskörper Unterkonstruktionen und der Netzhaut zugrunde liegen mehrere vitreoretinale Krankheiten, einschließlich Netzhauteinriss und Loslösung, Macular Pucker, Makula-Loch, altersbedingter Makula-Degeneration, vitreomacular Traktion, proliferative Vitreoretinopathie, proliferative diabetische Retinopathie, und erbte vitreoretinopathies. ^1,2 Die molekulare Zusammensetzung des Glaskörpers Unterkonstruktionen ist nicht bekannt. Da der Glaskörper ist transparent mit begrenzten chirurgischen Zugang, ist es schwierig gewesen, seine Unterkonstruktionen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Wir entwickelten ein Verfahren zur Trennung und zur Erhaltung dieser Gewebe für Proteomik und biochemische Analyse. Die Dissektionstechnik in diesem experimentellen Video zeigt, wie Glaskörperbasis, anterior hyaloidea, glasigen Kern und Glaskörper Kortex von postmortalen menschlichen Augen zu isolieren. Eindimensionale SDS-PAGE-Analysen der einzelnen Glaskörper Komponente gezeigt, dass unsere Dissektionstechnik in vier einzigartigen Protein-Profilen, die der jeweiligen Unterkonstruktion des menschlichen Glaskörpers geführt. Identifizierung von differentiell compartmentalized Proteine ​​wird zeigen, Kandidaten-Moleküle zugrunde liegenden verschiedenen vitreoretinale Krankheiten.

Protocol

1. Anterior Segment Dissection.

1. Die Hornhaut wird zunächst durch einen Einschnitt am Limbus in die Vorderkammer mit einem 15 ° Klinge (Abbildung 1) entfernt. Dann eine Klinge von gekrümmten Hornhaut-Sklera-Schere ist in die Vorderkammer eingeführt. Umlaufende Schnitte in der Hornhaut gemacht, unmittelbar vor dem Limbus.
2. 0,12 Colibri Pinzette und Schere Westcott werden verwendet, um die Iris umfänglich anterior des Ziliarkörpers geschnitten.
3. Der Linsenkern wird mit 0,12 Colibri Zange oder einem 15 °-Klinge (superscharfen) und der Hirnrinde und Kapsel mit einer Pinzette entfernt.

2. Glaskörper-Core Aspiration.

1. Ein 23-Gauge-Nadel auf einer 5-ml-Spritze ist in der Mitte eingesetzt Glaskörper (Abbildung 1).
2. Etwa 1 ml oder mehr glasigen Kern ist vorsichtig abgesaugt.
3. Die Probe wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt.

3. Anterior hyaloiden Dissection.

1. Der vordere hyaloidea ist als semi-transparent Ring durch die Anpassung des einfallenden Lichts von einem Schwanenhals Mikroskop Licht gesehen. Vorherige Aspiration des Glaskörpers Kern trennt den vorderen hyaloiden von anderen Strukturen zur leichteren Identifizierung.
2. Das Blatt aus elastischem Gewebe wird vorsichtig vom Ziliarkörper mit Colibri oder Kornzange gezogen und schneiden Sie mit Vannas Schere. Dieses Manöver wird wiederholt.
3. Die Probe wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt.

4. Glaskörperbasis Dissection.

1. Mit 0,12 Pinzette auf die Augenmuschel zu stabilisieren, werden Westcott Schere "Blume" das Auge, indem sie vier gleichmäßig verteilte Spannungsarmglühen Schnitte aus dem Ziliarkörper in Richtung des Sehnervenkopfes eingesetzt.
2. Die Pars plicata des Ziliarkörpers (Abbildung 2) ist aus jedem der Quadranten mit Westcott Schere entfernt.
3. Der Glaskörper Basis wird dann auf beiden Seiten der Ora serrata mit einer Pinzette über die pars plana und der Netzhaut (Abbildung 2) erfasst.
4. Kontinuierliche Traktion auf den Glaskörper Basis ist mit der Zange angewendet. Sequential Schneiden mit Westcott Schere extrahiert eine semi-transparente Gewebe mit einer "Perlenkette" Erscheinungsbild, wie es ist herausgeschnitten.
5. Die Probe wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt.

5. Vitreous Cortex Removal.

1. Die Pars plana ist aus jedem der Quadranten mit Westcott Schere durch Abschneiden der Broschüre ca. 3-mm hinter der Ora serrata (Abb. 2) herausgeschnitten.
2. Zwischen dem Gewebe Flugblätter, wird der Glaskörper Kortex visualisiert als halb transparente Folie.
3. Die elastische Folie ist entweder mit 0,12 Pinzette gefaßt oder über die Zugehörigkeit zu einer Weck-Cel chirurgischen Schwamm. Der Glaskörper Kortex wird dann von der Netzhaut und zog ausgeschnitten mit Westcott Schere (Abbildung 1).
4. Die Probe wird in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt. Alle Proben werden bei -80 ° C bis zum Experimentieren genutzt.

6. Repräsentative Ergebnisse

Gewebeproben können durch eine Vielzahl von Methoden für bestimmte Experimente verarbeitet werden. In unserem Fall wurden die Proben für Protein-Analyse durch SDS-PAGE (Abbildung 3) vorgelegt.

Abbildung 1. Querschnitt des menschlichen Auges darstellen verschiedenen Teilstrukturen des Glaskörpers. Die vorderen Glaskörper ist eine dünne kollagenen Schicht bezeichnet den vorderen hyaloidea. Der Glaskörper Kern umfasst das gesamte zentrale Bereich des Glaskörpers. Dieser Teil des Glaskörpers ist wässrigen im Gegensatz zu den Glaskörper Basis, die viskos genug, um mit einer Pinzette fassen und ist fest mit dem darunter liegenden Ziliarkörper und Retina befestigt ist. Umfasst den Glaskörper Kern ist eine sehr dünne kollagene Shell aufgerufen Glaskörper Kortex.

Abbildung 2. Glaskörperbasis Anatomie. Der Glaskörper Basis ist eine semi-transparente Unterbau des Glaskörpers an der Ora serrata (weiße Pfeile), die die Trennlinie Trennung des Ziliarkörpers und der Netzhaut liegt. Der vordere Rand des Glaskörpers Basis erstreckt sich über die pars plana (weiße Linie) des Ziliarkörpers. Der hintere Rand des Glaskörpers Basis erstreckt 2-3 mm hinter der Ora serrata (weiß Bindestrich). Verbrauchsteuerpflichtige die Glaskörperbasis sind Pinzette verwendet, um das Gewebe zu erfassen und ziehen Sie sie weg von der zugrunde liegenden Ziliarkörper und Retina. Einmal erhöht, Westcott Schere werden verwendet, um an der Basis abgeschnitten.

Abbildung 3. Eindimensionale SDS-PAGE des Glaskörpers Elements. Gesamt-Protein-Konzentrationen für den vorderen hyaloidea, Glaskörperbasis, vitreous Kern und Glaskörper Kortex wurden 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / ml. Gel-Elektrophorese wurde bei 200 kV für 45 Minuten durchgeführt, gefärbt mit Flamingo (Bio-Rad), und visualisiert mit Hilfe eines VersaDoc Imaging System (Bio-Rad). Die Profile für die verschiedenen Gewebe zeigen mehrere ähnliche Bands, aus der entweder konserviert oder Cross-kontaminierenden Proteinen, sowie einzigartige Bands (Stern), was darauf hinweist unterschiedlich lokalisierte Proteine.

Discussion

Der Glaskörper ist eine semi-transparente Gel, dessen molekulare Zusammensetzung ist weitgehend unverstanden, vor allem auf der Ebene der Unterkonstruktion: Der Glaskörperbasis, Kern, Kortex und anterioren hyaloidea. Der Glaskörper Kern enthält Kollagene II, V, IX und XI, zusammen mit Chondroitinsulfat Proteoglykane, Heparansulfat Proteoglykane und Hyaluronsäure. ^1,2 Protein-Biomarkern in den Glaskörper Kern haben mit Krankheiten wie diabetische Retinopathie in Verbindung gebracht worden. ^3-5 Wie Diese Proteine ​​sind unterschiedlich in den einzelnen Substrukturen ausgedrückt, und in vielen Fällen das spezifische Protein-Identitäten sind nicht bekannt. Diese Angaben können Einblick in die Herkunft der Proteine ​​mit spezifischen vitreoretinale Erkrankungen geben und helfen Ziel zukünftige Therapien. Obwohl die optimale post mortem Intervall für Gewebedissektion wurde nicht bestimmt, so kann Proteinabbau beeinträchtigen nachgeschaltete Experimente. Zum Beispiel ist die Immunhistochemie in 12-Stunden post mortem Augen betroffen und einige spezifische Enzymaktivitäten können innerhalb weniger Stunden reduziert werden (unveröffentlichte Beobachtung). Alle Gewebe in dieser Studie waren zwischen 2 und 8 Stunden nach dem Tod, ohne wesentliche Änderungen in der Proteinexpression oder der Eignung für die Proteomik analsyis gesammelt. Der flüssige Stickstoff Einfrieren Verfahren zur Haltbarmachung über Fixierung gewählt, um kleine Veränderungen in der Proteinstruktur von Fixativ Vernetzung, die in anderen Geweben wurde durch LC-MS/MS demonstriert verhindern. ⁶ Proteomic Studien werden sich auf die Fähigkeit, genau ab sezieren den verschiedenen Kompartimenten des Glaskörpers, wie in diesem Video Experiment gezeigt. Wir haben die Dissektionstechnik mit 1-dimensionale SDS-PAGE bestätigt. Wie unsere Ergebnisse zeigen, gibt es unterschiedlich Proteine ​​in den verschiedenen Glaskörper Unterkonstruktionen ausgedrückt. Die Identifizierung dieser Proteine ​​liefert ein detaillierteres Verständnis der Glaskörper Abschottung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.12 forceps	Storz Ophthalmics	E1502
5-cc syringe	BD Biosciences	309603
Straight Dressing Forceps With Serrations	Storz Ophthalmics	E1400
23 gauge needle	BD Biosciences	305145
Colibri forceps	Storz Ophthalmics	2/132
Castroviejo angled corneal scissors	Storz Ophthalmics	E3223
Vannas Curved Capsulotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3387
Weck-Cel surgical spears	Medtronic Inc.	0008680
Westcott Curved Tenotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3320