Summary
Denna video visar en effektiv teknik för att skilja och dissekera de olika semi-transparent struktur av den mänskliga glaskropp i post mortem ögon.
Abstract
Glaskroppen är ett optiskt klar, kollagen extracellulärmatrix som fyller insidan av ögat och overlies näthinnan. 1,2 Onormala interaktioner mellan glaskroppen delstrukturer och näthinnan ligger bakom flera vitreoretinala sjukdomar, inklusive näthinneruptur och avskildhet, fläckvisa rynka, fläckvisa hål, åldersrelaterad makuladegeneration, vitreomacular dragkraft, proliferativ vitreoretinopathy, proliferativ diabetesretinopati, och ärvda vitreoretinopathies. 1,2 Den molekylära sammansättningen av glaskroppen understrukturer inte är känd. Eftersom glaskroppen är öppen med begränsad kirurgisk åtkomst, har det varit svårt att studera dess understrukturer på molekylär nivå. Vi utvecklade en metod för att avskilja och bevara dessa vävnader för proteomik och biokemisk analys. Den dissekering tekniken i denna experimentella video visar hur isolera glaskroppen bas, främre hyaloid, glaskroppen kärna, och glaskroppen cortex från döden mänskliga ögon. Endimensionellt SDS-PAGE analys av varje glaskroppen komponent visade att våra dissektion teknik resulterat i fyra unika protein profiler som motsvarar varje underkonstruktion av den mänskliga glaskropp. Identifiering av differentiellt compartmentalized proteiner kommer att avslöja kandidat molekyler bakom olika vitreoretinala sjukdomar.
Protocol
1. Främre segmentet Dissection.
- Hornhinnan tas bort genom att först göra ett snitt vid limbus in i främre kammaren med en 15 ° blad (Figur 1). Sedan ett blad av krökta hornhinnan-skleral sax sätts in i främre kammaren. Omkretsen snitt görs i hornhinnan, bara främre till limbus.
- 0,12 Colibri pincett och Westcott saxar används för att klippa av iris runt om, främre till ciliarkroppen.
- Linsen kärnan avlägsnas med 0,12 Colibri pincett eller en 15 ° blad (supersharp) och cortex och kapseln med pincett.
2. Glasartade kärnor aspiration.
- En 23-gauge nål på en 5-cc spruta sätts in i mitten av glaskroppen (figur 1).
- Ungefär 1 ml eller mer av glaskroppen core är försiktigt aspireras.
- Provet placeras sedan i ett mikrofugrör och sedan i flytande kväve.
3. Anterior Hyaloid Dissection.
- Den främre hyaloid ses som en semi-transparent ring genom att justera det infallande ljuset från en gås hals mikroskop ljus. Tidigare aspiration av glaskroppen kärnan skiljer främre hyaloid från andra strukturer för lättare identifiering.
- Arket av elastiska vävnaden är noggrant dras bort från ciliarkroppen med Colibri eller dressing pincett och skär med Vannas sax. Denna manöver upprepas.
- Provet placeras sedan i ett mikrofugrör och sedan i flytande kväve.
4. Glasartade Base Dissection.
- Använda 0,12 pincett för att stabilisera ögat koppen är Westcott sax för att "blomma" ögat genom att göra fyra jämnt fördelade avstressande skär från ciliarkroppen mot papillen.
- Den pars plicata av ciliarkroppen (Figur 2) tas bort från varje kvadranter med Westcott sax.
- Glaskroppen bas är sedan förstått på vardera sidan av ora serrata med pincett över pars plana och näthinnan (figur 2).
- Kontinuerlig dragkraft på glaskroppen basen appliceras med pincett. Sekventiell skärning med Westcott sax extrakt en semi-transparent vävnad med ett "pärlband" utseende som det är censurerade.
- Provet placeras sedan i ett mikrofugrör och sedan i flytande kväve.
5. Glasartade Cortex Removal.
- Den Pars Plana skärs från varje kvadranter med Westcott sax genom att skära i bipacksedeln ca 3-mm posteriort om ora serrata (Figur 2).
- Mellan vävnaden flygblad är glaskroppen cortex visualiseras som en halvt genomskinlig film.
- Den elastiska filmen är antingen förstått med 0,12 pincett eller innehas av anslutning till ett Weck-Cel kirurgiska svamp. Glaskroppen cortex är sedan dras bort från näthinnan och utskurna med Westcott sax (Figur 1).
- Provet placeras i ett mikrofugrör och sedan i flytande kväve. Alla prover förvaras vid -80 ° C tills utnyttjas för experiment.
6. Representativa resultat
Vävnadsprover kan behandlas av en rad olika metoder för specifika experiment. I vårt fall var provexemplar som inlämnats för protein analys med SDS-PAGE (Figur 3).
Figur 1. Tvärsnittsarea bild av det mänskliga ögat skildrar olika understrukturer av glaskropp. De främre glaskroppen är ett tunt kollagen lager som kallas den främre hyaloid. Glaskroppen Kärnan omfattar hela centrala regionen av glaskropp. Denna del av glaskroppen är mer vatten i motsats till glaskroppen basen, som är trögflytande tillräckligt för att gripas av pincett och är fast knuten till underliggande ciliarkroppen och näthinnan. Omfattar glaskropp kärnan är en mycket tunn kollagen skal kallas glaskroppen cortex.
Figur 2. Glasartade bas anatomi. Den glaskroppen bas är en semi-transparent underbyggnad av glaskropp längs ora serrata (vita pilar), vilket är gränsen som skiljer ciliarkroppen och näthinnan. Den främre kanten av glaskroppen basen sträcker sig över Pars Plana (vit linje) i ciliarkroppen. Den bakre gräns glaskroppen basen sträcker 2-3-mm posteriort om ora serrata (vita streck). Punktskattepliktiga glaskroppen basen är peang används för att ta tag i vävnaden och dra bort från den underliggande ciliarkroppen och näthinnan. När förhöjd, Westcott sax används för att klippa längs basen.
Figur 3. Endimensionellt SDS-PAGE av glaskropp Elements. Totalprotein koncentrationer för främre hyaloid, glaskroppen bas, vitreous kärna, och glaskroppen cortex var 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / ml, respektive. Gelelektrofores utfördes på 200 kV i 45 minuter, färgade med Flamingo (Bio-Rad), och visualiseras med hjälp av en VersaDoc Imaging System (Bio-Rad). Profilerna för de olika vävnader visa flera liknande band och anger antingen bevaras eller mellan förorenande proteiner, samt unika band (asterisk), vilket indikerar differentiellt lokaliserad proteiner.
Discussion
Glaskroppen är en semi-transparent gel som molekylär sammansättning är dåligt känd, speciellt i nivå med dess understrukturer: glaskroppen bas, core, cortex, och främre hyaloid. Glaskroppen kärna innehåller kollagen II, V, IX och XI, tillsammans med kondroitinsulfat proteoglykaner, Heparan proteoglykaner sulfat och hyaluronan. 1,2 biomarkörer Protein i glaskroppen kärnan har förknippats med sjukdomar såsom diabetesretinopati. 3-5 Hur dessa proteiner är differentiellt uttryckta i varje underkonstruktioner, och i många fall de specifika proteinet identiteter, inte är kända. Dessa detaljer kan ge insikt till ursprunget av proteiner i samband med särskilda vitreoretinala sjukdomar och hjälpa behandlingar rikta framtiden. Även om den optimala obduktionen intervall för mjukpapper dissektion inte har bestämts, kan proteinnedbrytning påverka nedströms experiment. Till exempel är immunohistokemi påverkas i 12-timmars obduktion ögon och en del specifika enzymaktivitet kan minskas inom ett par timmar (opublicerad observation). Alla vävnader i denna studie samlades in mellan 2 och 8 timmars död utan betydande förändringar i proteinuttryck eller lämplighet för proteomik analsyis. Den flytande kväve fryser konserveringsmetoder valts framför fixering för att förhindra att små förändringar i proteiners struktur orsakad av fixativ kors länkning, vilket har visats i andra vävnader av LC-MS/MS. 6 proteomik studier kommer att bero på förmågan att korrekt dissekera de olika fack i glaskroppen, vilket visas i denna video experiment. Vi har validerat dissektion teknik med hjälp av 1-dimensionella SDS-PAGE. Eftersom våra resultat tyder på, finns det differentiellt uttryckta proteinerna i olika delstrukturer glaskropp. Identifiera dessa proteiner kommer att ge en mer detaljerad förståelse av glaskroppen uppdelning.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Finansieringen kom från Fight for Sight. Vävnader erhölls från Iowa Lions Eye Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.12 forceps | Storz Ophthalmics | E1502 | |
| 5-cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Straight Dressing Forceps With Serrations | Storz Ophthalmics | E1400 | |
| 23 gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Castroviejo angled corneal scissors | Storz Ophthalmics | E3223 | |
| Vannas Curved Capsulotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3387 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Westcott Curved Tenotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3320 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Sebag, J.
- Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
