Summary
우리는 쉽게 다른 뇌 영역 적용할 수 있습니다 organotypic hippocampal 조각을 준비하는 방법을 설명합니다. 뇌 조각이 인터페이스를 형성하기 위해 허용되는 구멍이 세포막과 문화 미디어에 누워있다. 이 방법은 최대 문화에 이주하는 해마의 매출 구조를 유지합니다.
Abstract
해마는 변연 계 시스템의 구성 요소, 장기 기억과 공간적 탐색 1 중요한 역할을 담당하고 있습니다. Hippocampal 신경 강력한 정품 인증 짧은 기간 이후에 그들의 연결 강도를 수정할 수 있습니다. 장기 potentiation (LTP)으로 알려진이 현상은, 몇 시간 또는 며칠 동안 지난 수 있으며, 학습과 기억이 가장 적합한 후보기구가되었다. 또한, 해마 3 잘 정의된 해부 및 연결은 시냅스 전달 및 시냅스 소성 4를 공부하는 클래식 모델 시스템을 만들었습니다.
hippocampal 시냅스의 생리에 대한 우리의 이해가 성장하고 분자 플레이어가 확인되자, 시냅스 단백질을 조작할 필요가 필수적이되었습니다. Organotypic hippocampal 문화는 쉬운 유전자 조작과 정확한 약리 개입 가능성을 제공하지만, 일상 문화 dissociated 뉴런 방법보다 더 자연 맥락에서 버렸네 기능을 이해하는 것이 중요합니다 신경 조직을 유지합니다.
여기 우리는 쉽게 다른 뇌 영역 적용할 수 있습니다 hippocampal 조각 준비하고 문화에 방법을 제시한다. 이 방법은 바이러스 감염 5,6 또는 biolistics 7과 같은 다른 방법을 사용하여 유전자 조작을위한 조각에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 또한, 조각 쉽게 생화학 assays 8 복구할 수, 또는 영상 9 electrophysiological 실험 10 현미경으로 전송.
Protocol
1. Hippocampal 조각의 준비를 시작하기 전에.
- 테플론 시트의 한 조각을 배치하고 새 블레이드를 장착하여 조직의 기계를 준비합니다.
- 70 % 에탄올과 조직 문화 (TC) 후드를 닦으과 해부 현미경 내부를 설정합니다. 후드, 현미경, 조직 슬라 이서 및 자외선과 함께 15 분 동안 모든 해부기구를 소독.
- 식스 웰 TC 플레이트를 준비합니다. 각 우물에 750 μL 슬라이스 문화 미디어 (SCM)마다 잘과 장소 세포 배양 삽입을 추가합니다. 점막이 아래없이 거품과 함께 철저하게 서부 유럽 표준시 있는지 확인합니다. 35 인큐베이터에있는 접시를 놓고 ° 필요한 때까지 C 5 % CO 2 가스에.
- 100 ML의 비이커에 50 ML 낮은 나 + ACSF을 (솔루션을 해부) 기름을 붓고 얼음 소금 믹스에 배치하십시오. 버블은 낮은 나 + ACSF는 5 % CO 2 / 95% O 2 컬러 변경 및 ACSF은 냉동 액체 용액 (10-20 분)의 슬러리 혼합을 형성까지.
- P5 - P7 랫은 새끼하십시오. 최대 3 새끼를 사용할 수 있습니다.
2. Hippocampal 슬라이스 준비.
- 날카로운 유틸리티 가위로 동물의 머리를 잘라. 피부를 잘라 두개골을 노출. 작은 가위로 화살 봉합 따라 다음 interaural 라인을 따라 좌우로 절단하고하여 두개골을 엽니다. 정면에서 좌우로 옵션 상처는 뼈와 뇌 노출을 제거 촉진하기 만들 수 있습니다. 둥근 스푼 마이크로 주걱과 함께 신속하게 두뇌를 꺼내서 ~ 1 분 쉬고 솔루션을 해부의 슬러리에 놓으십시오. 60mm 요리에 얼음 추위 해부 솔루션 ~ 10 ML을 붓고와 비커에서 접시에 두뇌를 전송합니다. 두뇌는 솔루션을 해부으로 덮여 있어야합니다.
- 아래 현미경 해부 : 플레이스 두뇌와 60mm 요리의 하단에 눌러 해부 포셉있는 정중선에서 들고있어. midbrain을 떠나는 반구를 분리하는 해마 해부 도구를 사용하십시오. hippocampi는 다음 각 반구에 노출됩니다. 부드럽게 도구를 해부 말머리 말머리를 특종. 완전히 해마를 분리하고 가능한 한 그것을 청소하기 위해 해부 바늘을 사용합니다.
- P1000 필터 피펫 팁의 냈다 팁을 사용하여 부드럽게 해마를 기음과 조직 슬라이에 테플론 시트로 전송할 수 있습니다. 그 오목한 측면에 해마를 놓습니다.
- 코로나 섹션을 얻고 액체의 초과를 유출하는 블레이드 hippocampi의 직각을 맞춥니다.
- hippocampi 매 400 μm의를 얇게.
- 다른 냈다 P1000 필터 팁 및 감기에 SCM을 사용하여 기계에서 hippocampi을 얇게 60mm 요리 및 전송에 ~ 10 ML 추위 SCM 하거라. 거품을 만드는 피하십시오.
- 이리스 주걱과 직선 주걱의 도움으로 부드럽게 서로의 슬라이스를 구분한다.
- 손상 조각에서 잘 정의되고 손상되지 않은 조각 분리합니다.
3. Hippocampal 조각 문화
- 인큐베이터에서 SCM과 세포 배양 삽입과 여섯 잘 접시를 가져와. 다른 냈다 P1000 필터 팁의 도움으로, 멤브레인에 개별 조각 전송합니다. 막 당 4-5 슬라이스를 놓습니다. 조각 역시 삽입 벽 가까이에 또는 서로 가까운 장소에하지 않도록주의하십시오. 필요한 경우, 별도의 조각으로 이리스 주걱을 사용합니다. 초과 매체를 제거합니다. 그들은 막에있는 한 최대한 작은 조각으로 터치.
- 35 다시 인큐베이터로 판과 문화를 이동 ° C와 5% CO 2.
- 파스퇴르 피펫으로 SCM을 aspirating하여 TC 후드 안쪽 SCM 매 48 시간을 변경합니다. 잘마다 신선한 사전 예열 SCM의 750 μL를 추가합니다. 더 거품이 막 아래에 형성되지 않습니다 있는지 확인합니다.
4. 솔루션
- 낮은 나 + ACSF - 슬라이스 문화 분석 해 봅시다 솔루션
deionized 및 무균 H 2 O에 추가하려면 :500 ML에 대한 1000 ML의 경우 최종 농도 CaCl 2 (1 M) 0.5 ML 1 ML 1 ㎜ D - 포도당 0.901 g 1.802 g 10 MM KCl 0.149 g 0.298 g 4 MM MgCl 2 (1 M) 2.5 ML 5 ML 5 MM NaHCO 3 1.092 g 2.184 g 26 MM 자당 40g 80g 234 MM DPBS에 페놀 레드 솔루션 0.5 % 0.5 ML 1 ML 0.1 % V / V
믹스 ~ 30 분
Steril0.22μm 필터를 통해 통과하여는 어때
° C 이상 이개월 4 개 이상의 50 ML aliquots하고 저장하십시오. - 슬라이스 문화 매체 (SCM)
500 ML에 대한 1000 ML의 경우 최종 농도 멤 이글 매체 4.2 g 8.4 g 8.4 g / L 호스 혈청 열 inactivated 100 ML 200 ML 20% L - 글루타민 (200 ㎜) 2.5 ML 5 ML 1 ㎜ CaCl 2 (1 M) 0.5 ML 1 ML 1 ㎜ MgSO 4 (1 M) 1 ML 2 ML 2 MM 인슐린 (1 MG / ML), HCL 0.01 N에 녹아있는 0.5 ML 1 ML 1 MG / L 아스코르비 산, 솔루션 (25 % W / V) 0.024 ML 0.048 ML 0.00125 % D - 포도당 1.16g 2.32g 13 MM NaHCO 3 0.22g 0.44g 5.2 MM Hepes 3.58g 7.16g 30 MM
완전히 녹아까지 섞어 실온에 가져와.
1 N NaOH로 7.27-7.28로 산도를 조정
측정 osmolarity. deionized 및 소독 H 2 O.과 320 mmol / kg으로 조정 약 25-40 ML을 추가할 예정입니다. 다시 osmolarity를 확인하십시오.
osmolarity를 조정하면서 *** 산도가 약간 변경될 수 있습니다,이 괜찮습니다, 그것은 osmolarity가 올바른 범위 (317-323)에있는 것을 더 중요합니다.
0.22 μm의 필터를 통해 통과하여 소독.
4 2 대 3 주 20 ML aliquots하고 저장하십시오 ° C.
Gluatamine 재고 : 2.5 ML의 aliquots에서 -20 ° C에서 200 mm까지와 저장소의 농도에서 준비합니다.
아스코르비 산 주식 : 25 %의 농도 (W / V)에서 준비하고 100 μL의 aliquots에서 -20 ° C에 저장됩니다.
5. 대표 결과 :
조각은 검은 반점이없는 해부 현미경 흰색 외관과 잘 정의되고 손상되지 않은 CA1, CA3 및 이가있는 이랑 지역 것입니다. 박테리아 오염은 쉽게 SCM의 매체 또는 탁도에 검은 점들을 이동으로 볼 수 있습니다. 현미경으로 배치하면, 단면의 표면은 분명하고 discernibly 세포 기관과 문화 4 일 후에 깨끗하게 보일 것입니다. 더 명확한 세포 기관은 본 적이 있고 많은 부스러기 4 일 후에 표면을 다루고있다면 건강 슬라이스되지 않습니다.
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Discussion
이 방법은 11. 첫째 Stoppini 외에 기술된 방법에 따라 문화 hippocampal 조각하는 빠른 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 부분은 조각이 멸균 유지하는 것입니다, 따라서 그것은 적절한 살균 기술을 사용하고 적절히 조직과의 접촉에있는 모든 자료를 소독하고 소독하는 것이 중요합니다.
다른 serums 소스는 조각의 품질에 영향을 미칠 수있다. 우리는 처음 몇 번이나 테스트하는 것이 좋습니다. 오염 문제가 재발하는 경우, 보육 및 오염의 가능성 소스에 대한 조직 문화 후드를 확인하십시오. 모든 절차를 수행하는 동안 살균 기술의 적절한 사용은 필수적입니다.
잘린에서 막과 보육의 조각 배치하는 총 시간은 1.5 시간보다 더 이상이어야합니다. 절차가 너무 오래 걸린다면, 그것은 조각의 건강을 손상됩니다.
모세관 현상에 의해 형성 SCM의 얇은 레이어를 통해 다공성 멤브레인 보증 적절한 산소와 영양의 조각 배치. 이 방법은 조직의 밀도는 적절한 산소와 영양분 침투를 허용 제공하는 다른 뇌 영역 적용할 수 있습니다. 따라서, 조직 밀도는 젊은 조직이 방법을 제한합니다. 해마 들어, P6 - P7 동물 300-400 μm의 두께 조각은 최상의 결과를주는 것 같습니다. 조각의이 유형은 급속하게 조직이 공기에 노출되는 시간이 떨어지면서 조직 슬라이와 함께 얻을 수 있습니다.
중요한 것은 문화의 몇 일 후에, 신경 생리를 연구들을 위해, 죽은 세포에서 그 잔해가 electrophysiological 또는 이미징 실험을위한 깨끗한 표면이 매우 적합 떠나, 제거되었습니다. 또한, organotypic hippocampal 조각은 급성 조각 12 비교 일반적인 연결을 개발하고 계속합니다. 뉴런은 통에 시냅스 활동을 증가 너무 많은 연결을 형성하기 시작하지만 이주 후 문화에 정상적인 연결이 사라집니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NINDS에 의해 투자되었다 - NIH R01NS060756은
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
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