Summary
Wir beschreiben eine Methode zur organotypischen Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden vorbereiten können. Hirnschnitten sind auf porösen Membranen und Kulturmedien ist erlaubt, um eine Schnittstelle bilden gelegt. Diese Methode schont die grobe Architektur des Hippocampus für bis zu 2 Wochen in Kultur.
Abstract
Der Hippocampus, einer Komponente des limbischen Systems, spielt eine wichtige Rolle in das Langzeitgedächtnis und die räumliche Navigation 1. Hippocampus-Neuronen können die Stärke ihrer Verbindungen nach kurzen starke Aktivierung ändern. Dieses Phänomen, das als Langzeit-Potenzierung (LTP) bekannt ist, kann für Stunden oder Tage dauern und ist mittlerweile der beste Kandidat Mechanismus für Lernen und Gedächtnis 2. Darüber hinaus hat der gut definierten Anatomie und Konnektivität des Hippocampus 3 hergestellt ist ein klassisches Modellsystem zur synaptischen Übertragung und synaptische Plastizität 4-Studie.
Als unser Verständnis der Physiologie des Hippocampus Synapsen wuchs und molekulare Spieler identifiziert wurde, wurde die Notwendigkeit, synaptischer Proteine zu manipulieren unerlässlich. Organotypischen hippokampalen Kulturen bieten die Möglichkeit für eine einfache Genmanipulation und präzise pharmakologische Intervention, sondern pflegen synaptischen Organisation, die entscheidend für das Verständnis Synapse Funktion in einem naturalistischen Kontext als Routine-Kultur dissoziierten Neuronen Methoden ist.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Vorbereitung und Kultur Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden können. Diese Methode ermöglicht den einfachen Zugriff auf die Scheiben zur genetischen Manipulation mit unterschiedlichen Ansätzen, wie virale Infektionen oder 5,6 Biolistik 7. Darüber hinaus können Scheiben leicht für biochemische Assays 8 gewonnen werden, oder an Mikroskopen für die Bildgebung 9 oder elektrophysiologischen Experimenten 10.
Protocol
1. Vor dem Start der Vorbereitung von Schnitten des Hippocampus.
- Bereiten Sie das Gewebe Allesschneider, indem ein Stück Teflon Blatt und Montage einer neuen Klinge.
- Wischen Sie die Gewebekultur (TC) Kapuze mit 70% Ethanol und stellen Sie die Präpariermikroskop innen. Sterilisieren der Haube, Mikroskop, Gewebe Hobel und alle Sezierbesteck für 15 Minuten mit UV-Licht.
- Bereiten Sie sechs gut TC-Platten. Add 750 ul Stück Kultur Medien (SCM) pro Vertiefung und Ort Zellkultureinsätzen in jede Vertiefung. Sicherstellen, dass die Membranen sind völlig nass ohne Blasen darunter. Legen Sie die Platten im Brutschrank bei 35 ° C mit 5% CO 2 begast, bis sie benötigt.
- Gießen Sie 50 mL niedrigen Na + ACSF (Sezieren Lösung) in einem 100 mL Becherglas und stellen Sie es auf dem Eis-Salz-Mischung. Blase den niedrigen Na + ACSF mit 5% CO 2 / 95% O 2 bis zum Farbumschlag und ACSF bildet einen Schlamm-Mix von gefrorenen und flüssigen Lösung (10-20 min).
- Get a P5-P7 Jungtier. Bis zu drei Welpen eingesetzt werden kann.
2. Schnitten des Hippocampus Vorbereitung.
- Schneiden Sie den Kopf des Tieres mit scharfen Schere Dienstprogramm. Schneiden Sie die Haut und setzen den Schädel. Öffnen des Schädels durch Schneiden von Seite zu Seite entlang der interauralen Linie und dann entlang der Sagittalnaht mit einer kleinen Schere. Eine optionale Schnitt von Seite zu Seite in der Front gemacht zu erleichtern das Entfernen der Knochen und der Exposition des Gehirns sein. Scoop aus dem Gehirn schnell mit einem abgerundeten Löffel Mikrospatel und legen Sie sie in die Gülle zu sezieren Lösung für ~ 1 Minute chill. Gießen Sie ca. 10 mL eiskaltem Sezieren Lösung auf eine 60 mm Schale und den Transfer des Gehirns aus dem Becher in die Schale. Das Gehirn soll mit Sezieren Lösung abgedeckt werden.
- Unter dem Binokular: Place des Gehirns und halten Sie ihn an der Mittellinie mit der Pinzette gedrückt, um den unteren Rand des 60 mm Schale. Verwenden Sie den Hippocampus Sezieren Werkzeug, um die Halbkugeln Weglassen des Mittelhirns zu trennen. Der Hippocampus werden dann auf jeder Hemisphäre ausgesetzt. Dann vorsichtig mit einer Schaufel Hippocampus mit dem Hippocampus Sezieren Werkzeug. Verwenden Sie die Präpariernadel völlig zu isolieren Hippocampus und reinigen Sie sie so weit wie möglich.
- Mit einem snipped Spitze eines P1000 Filter Pipettenspitze vorsichtig aspirieren Hippocampus und überträgt es auf die Teflon Folie auf das Gewebe Schneidemaschine. Position des Hippocampus auf der konkaven Seite.
- Richten Sie die hippocampi senkrecht zur Klinge koronalen Abschnitte zu erhalten und Drain überschüssige Flüssigkeit.
- Schneiden Sie die hippocampi alle 400 um.
- Gießen Sie ca. 10 ml kaltem SCM in eine 60 mm Schale und den Transfer in Scheiben geschnitten hippocampi vom Allesschneider mit anderen snipped P1000 Filter Spitze und kalten SCM. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Mit Hilfe eines Iris-Spachtel und einer geraden Spatel vorsichtig trennen die Scheiben voneinander.
- Separate gut definiert und unbeschädigt Scheiben von beschädigten Scheiben.
3. Schnitten des Hippocampus Kultur
- Bringen Sie die Sechs-Well-Platten mit SCM-und Zellkultur-Einsätze aus dem Inkubator. Mit Hilfe eines anderen snipped P1000 Filter Spitze, Transfer einzelnen Scheiben auf die Membran. Legen Sie 4-5 Scheiben pro Membran. Achten Sie darauf, statt der Scheiben entweder an die Wand legen nahe oder dicht beieinander. Wenn nötig, verwenden Iris Spatel zu trennen Scheiben schneiden. Entfernen Sie überschüssiges Medium. Touch-Scheiben so wenig wie möglich, sobald sie auf der Membran sind.
- Bewegen Platte zurück zum Inkubator und Kultur bei 35 ° C und 5% CO 2.
- Ändern SCM alle 48 Stunden innerhalb des TC Haube durch Absaugen des SCM mit einer Pasteurpipette. Add 750 ml frisches vorgewärmtes SCM pro Vertiefung. Achten Sie darauf, keine Blasen unter der Membran gebildet werden.
4. Lösungen
- Low Na + ACSF - Dissecting Lösung für Slice Kulturen
Um deionisiertem und sterilem H 2 O hinzu:Für 500 ml Für 1000 ml Endkonzentration CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 mL 1 mM D-Glucose 0,901 g 1,802 g 10 mM KCl 0,149 g 0,298 g 4 mM MgCl 2 (1 M) 2,5 ml 5 mL 5 mM NaHCO 3 1,092 g 2,184 g 26 mM Sucrose 40 g 80 g 234 mm Phenolrotlösung 0,5% in DPBS 0,5 ml 1 mL 0,1% v / v
Mix ~ 30 min
Sterilize Durchgang durch 0,22 &mgr; m-Filter
Machen Sie 50 mL aliquotiert und bei 4 ° C nicht länger als 2 Monate. - Slice-Kulturmedium (SCM)
Für 500 ml Für 1000 ml Endkonzentration MEM Eagle Medium 4,2 g 8,4 g 8,4 g / l Pferdeserum hitzeinaktiviertem 100 mL 200 mL 20% L-Glutamin (200 mM) 2,5 ml 5 mL 1 mM CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 mL 1 mM MgSO 4 (1 M) 1 mL 2 mL 2 mM Insulin (1 mg / mL), gelöst in 0,01 N HCl 0,5 ml 1 mL 1 mg / l Ascorbinsäure, Lösung (25% w / v) 0,024 ml 0,048 ml 0,00125% D-Glucose 1.16g 2.32g 13 mM NaHCO 3 0.22g 0,44 g 5,2 mm Hepes 3.58g 7.16g 30 mM
Mix bis gänzlich aufgelöst und auf Raumtemperatur bringen.
Der pH-Wert auf 7,27 bis 7,28 mit 1 N NaOH
Messen Osmolarität. Passen Sie auf 320 mmol / kg mit deionisiertem und sterilisiert H 2 O. Erwarten Sie etwa 25-40 ml hinzuzufügen. Überprüfen Sie Osmolarität wieder.
*** PH-Wert kann etwas ändern beim Einstellen der Osmolarität, das in Ordnung ist, ist es umso wichtiger, dass die Osmolarität im richtigen Bereich (317-323) ist.
Sterilisieren durch Passage durch 0,22 um-Filter.
Machen Sie 20 mL Aliquots und speichern bis zu 2-3 Wochen bei 4 ° C.
Gluatamine Lager: Vorbereitung in einer Konzentration von 200 mM und bei -20 ° C in Aliquots von 2,5 mL.
Ascorbinsäure Lager: Vorbereitung in einer Konzentration von 25% (w / v) und bei -20 ° C in Aliquots von 100 ul.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Scheiben aussehen sollte unter einem Binokular weiß ohne schwarze Flecken und gut definiert und unbeschädigt CA1, CA3 und Gyrus dentatus Regionen. Bakterielle Kontamination ist leicht wie das Verschieben schwarze Flecken in der mittleren oder Trübung des SCM zu sehen. Wenn unter dem Mikroskop gelegt, sollte die Oberfläche der Scheibe schauen nach 4 Tagen in Kultur sauber mit klaren und nachvollziehbaren Zellkörper. Wenn keine klare Zellkörper zu sehen sind und viel Schutt bedeckt die Oberfläche nach 4 Tagen, dann ist keine gesunde Scheibe.
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Discussion
Diese Methode basiert auf der Methode zuerst von Stoppini et al beschrieben ist. 11 und bietet eine schnelle Art und Weise zur Kultur Schnitten des Hippocampus. Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls ist die Erhaltung Scheiben steril, daher ist es wichtig, geeignete sterile Techniken zu verwenden und richtig zu desinfizieren und sterilisieren das gesamte Material in Kontakt mit dem Gewebe.
Verschiedene Seren Quellen können Einfluss auf die Qualität der Scheiben. Wir empfehlen, mehrere Chargen zuerst. Bei Verunreinigungen ist ein immer wiederkehrendes Problem, überprüfen Inkubator-und Gewebekultur Haube für mögliche Quellen der Verunreinigung. Der richtige Einsatz von sterilen Techniken während des gesamten Verfahrens ist von wesentlicher Bedeutung.
Die Gesamtzeit von Enthauptung dem Platzieren der Scheiben auf der Membran und in den Inkubator sollte nicht länger als 1,5 Stunden. Wenn das Verfahren zu lange dauert, wird es Kompromisse, die Gesundheit der Scheiben.
Platzieren der Scheiben auf einer porösen Membran Garantien richtige Sauerstoffzufuhr und Ernährung über eine dünne Schicht von SCM, die durch Kapillarität gebildet wird. Diese Methode kann auch auf andere Hirnregionen vorausgesetzt, dass die Dichte des Gewebes richtige Sauerstoffzufuhr und Nährstoff-Penetration ermöglicht angepasst werden. Somit begrenzt Gewebedichte diese Methode, um junge Gewebe. Für Hippocampus scheinen Scheiben 300-400 um dick aus p6 p7-Tiere, um beste Ergebnisse zu geben. Diese Art der Scheiben kann schnell mit einem Papiertaschentuch Allesschneider Verringerung der Zeit, das Gewebe der Luft ausgesetzt ist, erhalten werden.
Wichtig für die Studierenden synaptischen Physiologie, nach ein paar Tagen in Kultur, hat alle die Trümmer von toten Zellen entfernt worden, so dass eine saubere Oberfläche sehr gut für elektrophysiologische oder bildgebende Experimente. Darüber hinaus fortsetzen organotypischen Schnitten des Hippocampus zu entwickeln normale Konnektivität vergleichbar mit akuten Scheiben 12. Jedoch nach 2 Wochen in Kultur das normal Konnektivität verschwindet Neuronen bilden zu viele Verbindungen, die synaptische Aktivität steigt in die Scheibe zu starten.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NINDS finanziert - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
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