Summary
Een methode voor RNA-interferentie (RNAi) door injectie van dsRNA in unfed teken wordt beschreven. RNAi is de meest gebruikte gen-silencing-techniek in teken waar het gebruik van andere methoden van genetische manipulatie is beperkt.
Abstract
Teken zijn obligate hematophagous ectoparasieten van wilde en gedomesticeerde dieren en mensen, en worden beschouwd als tweede wereldwijd aan muggen als dragers van ziekten bij de mens 1 en de belangrijkste dragers van invloed zijn vee-industrie wereldwijd 2. Teken zijn ingedeeld in de subklasse Acari, orde Parasitiformes, onderorde Ixodida en worden wereldwijd gedistribueerd van Arctic naar tropische gebieden 3. Ondanks inspanningen om teek controle, deze ectoparasieten blijven een ernstig probleem voor de menselijke en dierlijke gezondheid 4,5.
RNA-interferentie (RNAi) 6 is een nucleïnezuur gebaseerde reverse genetische benadering dat de verstoring van de genexpressie gaat om gen-functie of het effect te bepalen op een metabole route. Kleine interfererende RNA's (siRNA's) zijn de effector moleculen van de RNAi pathway die door double-stranded RNA (dsRNA) en resultaten geïnitieerd in een krachtige sequentie-specifieke afbraak van cytoplasmatische mRNA's met dezelfde volgorde als de dsRNA trekker 7-9. Post-transcriptionele gene silencing mechanismen op initiatief van dsRNA zijn ontdekt in alle eukaryoten studeerde tot nu toe, en RNAi is snel ontwikkeld in een verscheidenheid van organismen als hulpmiddel voor functionele genomica studies en andere toepassingen 10.
RNAi is uitgegroeid tot de meest gebruikte gen-silencing techniek in teken en andere organismen, waar alternatieve benaderingen voor genetische manipulatie zijn niet beschikbaar of onbetrouwbaar 5,11. De genetische karakterisering van teken is beperkt tot de recente toepassing van de RNAi 12,13. In de korte tijd dat RNAi beschikbaar is geweest, is gebleken een waardevol instrument voor het bestuderen van tik-gen functie, de karakterisering van de teek-pathogeen-interface en de screening en de karakterisering van vink beschermende antigenen 14 worden. Hierin is een methode om door middel van RNAi injectie van dsRNA in unfed teken beschreven. Het is waarschijnlijk dat de kennis die is opgedaan met deze experimentele aanpak sterk zal bijdragen aan het begrip van de fundamentele biologische systemen en de ontwikkeling van vaccins om teek beheersen en te voorkomen overdracht van door teken overgedragen pathogenen 15-19.
Protocol
1. Generatie van dsRNA.
- Synthetiseren oligonucleotideprimers met T7 promoter sequenties voor in vitro transcriptie en synthese van dsRNA (bijvoorbeeld voor Dermacentor variabilis subolesin gebruik van oligonucleotide primers D8AAT75:
5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'en D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). - Amplify target-gen door RT-PCR met behulp van 10 pmol van elke oligonucleotide primer en 1-10 ng van teken totaal RNA.
- Zuiveren de PCR-product.
- Synthetiseren dsRNA met 8 pi van het gezuiverde PCR-product.
- Kwantificeren dsRNA door spectrometrie.
2. Injectie van Teken met dsRNA.
2.1. De voorbereiding van teken voor injectie.
- Was eerst de teken in een reeks van oplossingen door schudden ze in elke oplossing in een 50 mL wegwerp centrifugebuis, decanteren de oplossing door een fijne gaas-scherm over de buis van boven naar de teken te behouden. De volgorde van de oplossingen voor het wassen van teken is leidingwater, 3% waterstof peroxide, twee wasbeurten van gedestilleerd water, 70% ethanol en twee meer wassen met gedestilleerd water.
- Dep droog de teken op keukenpapier.
- Tel de teken in groepen van 20 tot 50, afhankelijk van het experiment, plaatst u de teken uit elke groep in een 1.25 oz plastic bekertje met een strak gemonteerd deksel en etiket met de experimentele groep nummer.
2.2. Tick injectie team.
Het RNAi-team bestaat uit drie personen: (1) een persoon die iedere tik posities op dubbele kleefband aangebracht op een vel rode tandartsen, (2) een persoon die injecteert het teken en (3) een persoon die de teken controleert na injectie, ademt CO 2 op het teken om ze te activeren en telt het levende teken in kopjes gelabeld met de experimentele groep nummer. Alle teamleden dienen wegwerphandschoenen te dragen.
2.3. Plaatsing van teken voor injectie.
- Leg een teek met behulp van Dumont fijn pincet en plaats het ventrale kant naar boven op de dubbele kleefband aangebracht op een 3 "x 6" vel rode tandartsen. De teken zijn nauw bij elkaar geplaatst in groepen van vijf teken.
- Leg een smalle strook afplaktape over de monddelen van alle vijf teken om verder te weerhouden hen, maar terwijl het grootste deel van het lichaam, zodat blootgesteld, zodat de injectie proces kan worden waargenomen door de teek injector (figuur 1).
2.4. Injectie van teken.
- Het teken zal worden geïnjecteerd in de rechter kwadrant van het ventrale oppervlak van het exoskelet.
- De eerste, Pierce een gat in het exoskelet met behulp van een Monoject insulinespuit uitgerust met een ½ ", 29 gauge naald (Figuur 2a).
- Onmiddellijk in te spuiten teken met 0,2-0,5 pl van dsRNA-oplossing (5 x 10 10 - 5 x 10 11 moleculen per pi) met behulp van een custom-made Hamilton spuit met een 1 inch, 33 gauge naald met een 45 ° schuine punt (Figuur 2b) . De naald moet goed worden geplaatst in de teek holte om de plaatsing en het behoud van de dsRNA te verzekeren. Wat vocht is waarschijnlijk te ontsnappen uit de injectieplaats (figuur 2c). Zorg ervoor dat u niet meer dan injecteren van de teken, die het verlies van hemolymfe zou veroorzaken en kan de dood van de teek kan veroorzaken.
- Reinig de Hamilton spuit na het voltooien van de injecties in elke experimentele groep. voordat u voor een andere experimentele groep. Vul eerst de spuit uit een bekerglas met 3% waterstofperoxide en vervolgens te verdrijven in een afvalcontainer, en herhaal 15 keer. Vul de spuit van een bekerglas met steriel water en vervolgens te verdrijven in een afvalcontainer, en herhaal 15 keer. Zorg ervoor dat de zuiger van de spuit Hamilton bocht omdat, als gebogen, de zuiger niet soepel bewegen en reageren op de zachte aanraking die nodig zijn voor de injectie van teken.
2.5. De behandeling van teken na de injectie.
- Pak de teek direct ingespoten van de dubbele kleefband met de fijne pincet en plaats deze in een plastic recovery container (ongeveer 6 "x 6" en geringd met tape om het ontsnappen van de teken te voorkomen). Het teken zal kort inactief worden na de injectie, maar moet al snel beginnen te kruipen rond het gerecht.
- Breath CO 2 op de teken onmiddellijk na het plaatsen van hen in het herstel container om te helpen de teken te activeren. Zodra de teken zijn kruipen en actief zijn, zal de injectie wond snel genezen en zullen ze waarschijnlijk overleven.
- Tel het teken op basis van het aantal in elke experimentele groep en plaats ze in een gemerkt plastic bekertje met een strak gemonteerd deksel. Vervanging teken moet geïnjecteerd worden aan een dat stierf voordat het injecteren van de volgende experimentele groep te vervangen.
2.6. Tick bedrijf.
- Plaats de teken in een vochtige kamer (12 uur licht: 12 uur donker fotoperiode bij 22-25 ° C en 95% relatieve humidity) en houd deze voor 1 dag.
- Plaats teken in teken geeft cellen, een per experimentele groep, verlijmd op een schaap en hen in staat stellen zich te voeden met een gelijk aantal uninjected mannelijk of vrouwelijk teken (wat seks was niet geïnjecteerd). Vrouwelijke teken dat de voeding naar repletie, hebben degenen die worden verwijderd uit de schapen na 10 dagen van het voeden, of wanneer de controle wijfjes afgezet de gastheer worden verzameld en gewogen.
- Plaats de teken in dozen, en houden in de vochtkamer tot de voltooiing van ovipositie. Evalueer ovipositie door weging van de ei massa geproduceerd door alle teken in de groep.
2.7. Analyse van de teek fenotype na RNAi.
- Evalueer vinkje fenotype na de voeding door het bepalen van het aantal teken dat overleefde, teek gewicht, ovipositie en ei vruchtbaarheid. Kunnen echter ook andere analyses worden uitgevoerd, afhankelijk van de specifieke gen en de doelstellingen van de studie.
3. Analyse om gene silencing Bevestig door RT-PCR.
- Ontleden speekselklieren en lef van individuele teken van controle-geïnjecteerde en dsRNA-geïnjecteerde groepen na de voeding.
- Extract totaal RNA van individuele weefselmonsters.
- Analyseren van target-gen transcripten in individuele weefsels door real-time RT-PCR en normaliseren RNA-niveau tegen teken 16S rRNA met behulp van de genNorm methode (DDCT methode zoals uitgevoerd door Bio-Rad iQ5 Standard Edition, versie 2.0).
- Run dissociatie curven aan het einde van de reactie om ervoor te zorgen dat er slechts een amplicon is gevormd en dat de amplicons denatureren consequent in hetzelfde temperatuurbereik voor ieder monster.
- Vergelijk mRNA niveaus (genormaliseerd Ct-waarden) tussen controle-geïnjecteerd en dsRNA-teken geïnjecteerd met behulp van de Student `s t-test (p = 0,05).
4. Representatieve resultaten:
Het protocol beschreven is gebruikt in ons laboratorium voor de RNAi in veel verschillende ixodid teek soorten (tabel 1). De hoeveelheid dsRNA geïnjecteerd in het teken varieert met de grootte van de teek, grotere tekensoorten zijn geschikt voor een groter volume. Negatieve controle teken moet worden geïnjecteerd met een niet-verbonden dsRNA. Verschillende dsRNA's zoals subolesin 14-19,22-25,27-32,34 en beta-actine 20,21 kan worden gebruikt als positieve controles. Merk op dat het belangrijk is te wassen de spuit tussen de behandelingen om het mengen van dsRNA-oplossingen te vermijden. Als het protocol is juist gebeurt, zal minder dan 5% sterfte worden verkregen van de injectie procedure na 24 uur. Een typische fenotype na-gen knock-down in teken is weergegeven in figuur 3 met een panel van teken geïnjecteerd met zwembaden van dsRNA om te screenen op aanvinken beschermende antigenen.
| Tekensoorten | dsRNA ingespoten | Referenties |
| Ixodes scapularis | cDNA bibliotheek, subolesin, actine, nucleotidase, NF-kB, akirin | 21, 22, 29, 30 |
| Dermacentor variabilis | subolesin, GST, ubiquitine, vATPase, selenoproteins M en W2a, hematopoietische stamcellen / voorlopercellen eiwit-achtige, actine proteasoom 26S-subunit, ferritin1, varisin, akirin | 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 |
| Dermacentor marginatus | subolesin | 22 |
| Amblyomma americanum | cDNA bibliotheek, subolesin, akirin | 17, 22, 30 |
| Amblyomma hebraeum | subolesin, voraxin | 28 |
| Rhipicephalus sanguineus | Rs86, subolesin | 22, 23 |
| Rhipicephalus MicroPlus | GST, ubiquitine, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a, flagelliform zijde proteïne, von Willebrand factor | 16, 18, 25, 27 |
| Rhipicephalus annulatus | ubiquitine, subolesin, EF1a, GIII | 16 |
Tabel 1. Tick soorten waarvan het RNAi-protocol is gebruikt.
Figuur 1. Plaatsing van teken, ventrale kant naar boven, op dubbele kleefband gehandeld op grond van een blad van de rode tandartsen. De teken zijn geplaatst in groepen van vijf, waarna een kleine strook tape wordt geplaatst over de monddelen om verder te beveiligen de teken terwijl de injector om het lichaam van de teek te observeren tijdens de injectie.
Figuur 2. De injectie procedure omvat (a) piercing rechtsonder kwadrant van de teek exoskelet met een insuline syRinge uitgerust met een 29 gauge naald in om een injectie te creëren, (b) directe injectie van de dsRNA op deze site met behulp van een Hamilton injectiespuit met een 33 gauge naald (c) het meest waarschijnlijk zal resulteren in een aantal lekken van teken hemolymfe / vloeistoffen.
Figuur 3. Een panel van teek zes groepen waarin RNAi werd gebruikt om te screenen op aankruisen beschermende antigenen in Amblyomma americanum. De fenotypische veranderingen in het teken kan worden gezien in vergelijking met de positieve subolesin RNAi-controle en de negatieve niets dsRNA controle. In dit experiment het effect van de RNAi op de pof sterfte, gewichten en ovipositie van elke groep was statistisch geanalyseerd.
Discussion
Hoewel andere methoden zijn beschreven voor RNAi in teken 14, 33, de injectie van dsRNA hier beschreven is de meest gebruikte zowel in unfed (tabel 1) en gevoed teken 16,25,34. RNAi is aangetoond dat het een waardevol instrument voor de studie van de teek gen functie, de karakterisering van de teek-pathogeen-interface en de screening en de karakterisering van vink beschermende antigenen 14,35 worden. In het bijzonder, RNAi uitgegroeid tot de meest waardevol instrument voor de functionele analyses in teken 35.
Methodologisch zal RNAi waarschijnlijk evolueren naar efficiëntere methoden dat gen knock-down kan toestaan in een groot aantal individuen. Het mechanisme van dsRNA-geïnduceerde RNAi in teken moeten worden verfijnd om bij te dragen tot een beter begrip en het gebruik van deze genetische aanpak in deze soort 35,36. De omvang van off-target effecten van RNAi in teken is ook een belangrijke vraag die moet volledig worden aangepakt 14,27. Tot slot zal RNAi waarschijnlijk bieden uitgebreide bijdragen aan de studie van de teek genregulatie en systeembiologie en de teek-pathogeen-interface en kan een invloed hebben op de ontwikkeling van vaccins aan te vinken plagen en de overdracht van door teken overgedragen pathogenen controle hebben.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken de leden van onze laboratoria voor vruchtbare discussies en technische bijstand. Deze video presentatie werd ondersteund door de Associate Dean voor Onderzoek en het Ministerie van Veterinaire Pathobiologie, Centrum voor Veterinaire Gezondheidswetenschappen, Oklahoma State University. Het onderzoek werd gefinancierd door het Ministerio de Ciencia e Innovación, Spanje (project BFU2008-01244/BMC), het CSIC intramurale project PA1002451 aan JF, de Walter R. Sitlington leerstoel voor de menselijke voeding Animal Research voor KMK, CVHS 2009 RAC verlenen, OAEs Animal Health fondsen en USDA, National Research Initiative Competitive Grant, nr. 2,007 tot 04,613.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Access RT-PCR system | Promega | A1250 | |
| Purelink PCR purification kit | Invitrogen | K3100-02 | |
| Megascript RNAi kit | Ambion | AM1626M | |
| Red dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72674 | |
| Plastic cups, 1.25 oz and lids | Solo Cup Company, Urbana Ill. | ||
| Fine forceps | Electron Microscopy Sciences | Various | |
| Insulin syringe | Monoject | Fitted with a ½", 29 gauge needle | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 701SN,33/.375”/45DGR | Custom made |
| TriReagent | Sigma | 93289 | |
| iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green | Bio-Rad | 170-8892 | |
| Real-time PCR detection system | Bio-Rad | Several | Please refer to http://www.bio-rad.com/ |
References
- de la Fuente, J. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).
- Peter, R. J. mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future. Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).
- Barker, S. C., Murrell, A. Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names. Parasitol. 129, S15-S36 (2004).
- Willadsen, P. Tick control: Thoughts on a research agenda. Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).
- de la Fuente, J., Kocan, K. M. Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species. Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Cerutti, H. RNA interference: traveling in the cell and gaining functions. Trends Genet. 19, 39-46 (2003).
- Kavi, H. H.
- Mello, C. C., Conte, D. J. r
- Zhou, D. RNA interference and potential applications. Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).
- Ramakrishnan, V. G. Application of RNA interference in tick salivary gland research. J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).
- Aljamali, M. N. RNA interference: applicability in tick research. Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).
- Aljamali, M. N. RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum. Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).
- de la Fuente, J. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
- de la Fuente, J. Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale. Genomics. 90, 712-722 (2007).
- AlmazäN, C. Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations. Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).
- de la Fuente, J. Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).
- Zivkovic, Z. Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale. BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).
- de la Fuente, J. Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin. Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).
- de la Fuente, J. RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens. Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).
- de la Fuente, J. The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction. Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).
- de la Fuente, J. Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference. Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).
- de la Fuente, J. Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference. Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).
- Nijhof, A. M. Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens. Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).
- Kocan, K. M. Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections. Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).
- de la Fuente, J. Evidence of the role of tick subolesin in gene expression. BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).
- Smith, A. The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition. Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).
- Galindo, R. C. Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates. Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).
- Canales, M. Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin. Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).
- Kocan, K. M. Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis. BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).
- Zivkovic, Z. Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks. BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).
- Karim, S. Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA. BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).
- Kocan, K. M. Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA. Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).
- de la Fuente, J. Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies. Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).
- Kurscheid, S. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).
