Summary
Метод РНК-интерференции (RNAi) путем инъекции дсРНК в голодные клещи описывается. RNAi является наиболее широко используемой генной глушителей технику в клещи, где использование других методов генетических манипуляций носит ограниченный характер.
Abstract
Клещи являются облигатными гематофагами эктопаразиты диких и домашних животных и людей, и считается вторым по всему миру для комаров как переносчиков болезней человека, 1 и наиболее важных векторов, влияющих скота промышленности во всем мире 2. Клещи, классифицируются в подклассе Acari, порядок Parasitiformes, подотряда Ixodida и распространяются по всему миру от Арктики до тропических регионах 3. Несмотря на усилия по контролю тик насекомых, это эктопаразитов остаются серьезной проблемой для здоровья человека и животных 4,5.
РНК-интерференция (RNAi) 6 на основе нуклеиновой кислоты обратный генетический подход, который включает в себя нарушение экспрессии генов, чтобы определить функции гена или его влияние на метаболические пути. Малых интерферирующих РНК (siRNAs) являются эффекторные молекулы путем РНК-интерференции, который проводится по инициативе двухцепочечной РНК (дсРНК) и приводит к мощным последовательности конкретных деградации мРНК, содержащих цитоплазматические же последовательности, что триггером дсРНК 7-9. После транскрипционных генов механизмы инициирован дсРНК были обнаружены у всех эукариот изучены до сих пор, и RNAi была быстро развивается в самых разных организмов, как инструмент для исследования функциональной геномики и других приложений, 10.
RNAi стало наиболее широко используемых генной глушителей технику в клещи и другие организмы, где альтернативные подходы в генетических манипуляций отсутствуют или являются ненадежными 5,11. Генетической характеристики клещей было ограничено до недавнего применения РНК-интерференции 12,13. В короткое время, что RNAi была доступна, она оказалась ценным инструментом для изучения функции генов тик, характеристика клеща возбудителя интерфейс и отбор и характеристика тик защитных антигенов 14. При этом, метод РНК-интерференции путем инъекции дсРНК в голодные клещи описано. Вполне вероятно, что знания, полученные из этого экспериментальный подход будет способствовать заметно на понимание основных биологических систем и разработка вакцин для контроля тик инвазии и предотвращения передачи клещевого патогенов 15-19.
Protocol
1. Генерация дсРНК.
- Синтез олигонуклеотидных праймеров, содержащих последовательности T7 промотор для транскрипции в пробирке и синтез дсРНК (например, для Dermacentor variabilis subolesin использованием олигонуклеотидных праймеров D8AAT75:
5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'и D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). - Amplify гена-мишени ОТ-ПЦР, используя 10 пмоль каждого праймера и олигонуклеотида 1-10 нг РНК тик общего количества.
- Purify продукта ПЦР.
- Обобщить дсРНК использовании 8 мкл продукта ПЦР очищенная.
- Количественная дсРНК по-спектрометрии.
2. Инъекция тики с дсРНК.
2.1. Подготовка клещей для инъекций.
- Во-первых, мыть клещей в серии решений, встряхивая их в каждом решении в 50 мл одноразовые трубки центрифуги, разливая раствор через мелкое сито проволочной сетки по трубке сверху сохранить клещей. Последовательность решений для мытья клещей водопроводной воды, 3% перекись водорода, два моет дистиллированной воды, 70% этанола и еще два моет дистиллированной водой.
- Пятно сухой клещей на бумажных полотенцах.
- Граф клещей на группы от 20 до 50, в зависимости от эксперимента, место клещей из каждой группы в 1,25 пластиковом стакане г с подогнаны крышки и этикетки с экспериментальными номер группы.
2.2. Тик инъекции команды.
Команда RNAi состоит из трех человек: (1) один человек, который позиции каждого тика на двойной клейкой ленты прикреплены к листу красной зубных слепков, (2) один человек, который вводит клещей и (3) один человек, который следит за клещей после инъекции, дышит CO 2 на клещей, чтобы активировать их и подсчитывает жизни клещей в чашки помечены экспериментальные номер группы. Все члены команды должны носить одноразовые перчатки.
2.3. Размещение клещей для инъекций.
- Захват тик использованием Дюмон штраф пинцетом и поместить его брюшной стороне на двойной клейкой ленты прикреплены к 3 "х 6" лист красной стоматологического воска. Клещей близко расположены вместе в группы по 5 клещей.
- Место небольшую полоску клейкой ленты на ротовых всех 5 тиков в целях дальнейшего удержать их, но, оставляя большую часть тела подвергается, так что инъекции процесс можно наблюдать тик инжектора (рис. 1).
2.4. Инъекция клещей.
- Тиков будет введен в правом нижнем квадранте брюшной поверхности экзоскелет.
- Во-первых, пробить отверстие в экзоскелет с помощью шприца Monoject инсулина оснащены ½ ", 29 иглы (рис. 2а).
- Inject клещей сразу же с 0,2-0,5 мкл раствора дсРНК (5 х 10 10 - 5 х 10 11 молекул в мкл) с использованием заказных Гамильтон шприц с 1 дюйм, 33 иглы с 45 ° скошенной точке (рис. 2б) . Иглы должны быть размещены также в тик полости, чтобы обеспечить размещение и хранение дсРНК. Некоторые жидкости, скорее всего, побег из места инъекции (рис. 2в). Следует проявлять осторожность, чтобы не вводить в течение клещей, которые будут вызывать потерю гемолимфы и может привести к гибели клеща.
- Чистая шприца Гамильтона после окончания инъекций в каждой экспериментальной группы. Перед использованием для другой экспериментальной группе. Заполните шприц сначала из стакана, содержащий 3% перекиси водорода, а затем высылать в контейнер для отходов, и повторите 15 раз. Заполните шприц из стакан, содержащий стерильной водой, а затем высылать в контейнер для отходов, и повторите 15 раз. Будьте осторожны, чтобы не погнуть поршень шприца Гамильтона, потому что, если изогнуты, поршень не будет двигаться плавно и реагировать на нежные прикосновения, необходимых для введения клещей.
2.5. Лечение клещей после инъекции.
- Возьмите вводят непосредственно из тика двойной клейкой ленты с тонким пинцетом и поместить его в пластиковый контейнер восстановления (примерно 6 "х 6" и кольчатой с клейкой лентой, чтобы предотвратить побег клещи). Клещи будут кратко неактивные после инъекции, но в ближайшее время должен начать ползать блюдо.
- Дыхание CO 2 на клещей сразу же после помещения их в контейнер для восстановления помочь активировать клещей. Как только клещи ползут и активным, инъекции рана будет заживать быстрее, и они, скорее всего, выжить.
- Граф клещей в зависимости от количества в каждой экспериментальной группы и поместите их в пластиковый стаканчик помечены с подогнаны крышкой. Замена клещей должен быть введен, чтобы заменить какой-либо, что любой умер перед инъекцией следующего экспериментальной группе.
2.6. Тик холдинга.
- Место клещей в камере влажности (12hr свет: 12 ч темно фотопериода на 22-25 ° С и 95% относительной чumidity) и удерживайте в течение 1 дня.
- Место клещей в тик-питание клеток, по одному в экспериментальной группе, приклеены к овцам и дать им возможность кормиться с равным количеством uninjected мужчина или женщина клещей (в зависимости от пола не вводили). Женский клещи, которые питаются в сытости, те, которые удаляются из овец через 10 дней после кормления или когда контроль самок высадили хост собираются и взвешиваются.
- Место клещей в картонных коробках, и держать в камере влажности до окончания яйцекладки. Оценка откладки яиц путем взвешивания яичная масса производимого всеми клещей в группе.
2.7. Анализ клеща фенотипа после RNAi.
- Оценка тик фенотипа после кормления, определяя количество тактов, которые выжили, отметьте вес, откладки яиц и яичных плодородия. Тем не менее, другие анализы могут быть выполнены в зависимости от целевого гена и задачи исследования.
3. Анализ для подтверждения генов ОТ-ПЦР.
- Рассеките слюнных желез и кишки от отдельных клещей из-под контроля впрыска и дсРНК впрыском групп после кормления.
- Извлечение общей РНК из отдельных образцов ткани.
- Анализ стенограмм гена-мишени в отдельных тканей в режиме реального времени RT-PCR и нормализовать уровни РНК против клещевого 16S рРНК использованием genNorm метод (метод ddCT как осуществляется Bio-Rad iQ5 Standard Edition, версия 2.0).
- Выполнить диссоциации кривых в конце реакции, чтобы только один ампликона формируется и что ампликонов денатурировать последовательно в том же диапазоне температур для каждого образца.
- Сравнить уровни мРНК (нормированные значения Ct) между контролем впрыском и дсРНК впрыском клещей использованием Студенческие т-тест (р = 0,05).
4. Представитель Результаты:
Протокол, описанный в этом документе, были использованы в нашей лаборатории для RNAi в самых разных видов иксодовых тики (табл. 1). Количество дсРНК вводят клещей зависит от размера тика; больше видов клещей может вместить больший объем. Отрицательные клещей контроль должен быть введен с несвязанными дсРНК. Несколько dsRNAs таких как subolesin 14-19,22-25,27-32,34 и бета-актин 20,21 можно использовать в качестве положительного контроля. Обратите внимание, что очень важно, чтобы вымыть шприц между курсами лечения, чтобы избежать смешивания растворов дсРНК. Если протокол будет сделано правильно, менее чем на 5% смертности должны быть получены из процедуры инъекции через 24 часа. Типичный фенотип гена после нокдауна в тактах показано на рисунке 3 с панели клещи вводят пулов дсРНК для того, чтобы показать на экране для клещ защитных антигенов.
| Тик видов | дсРНК вводили | Ссылки |
| Ixodes scapularis | кДНК библиотеки, subolesin, актин, нуклеотидазы, NF-Кб, akirin | 21, 22, 29, 30 |
| Dermacentor variabilis | subolesin, GST, убиквитин, vATPase, селенопротеинов M и W2A, гемопоэтических стволовых / прогениторных клеток белка, как, актин протеасомы 26S субъединицы, ferritin1, varisin, akirin | 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 |
| Dermacentor marginatus | subolesin | 22 |
| Amblyomma americanum | кДНК библиотеки, subolesin, akirin | 17, 22, 30 |
| Amblyomma hebraeum | subolesin, voraxin | 28 |
| Rhipicephalus шпеиз | Rs86, subolesin | 22, 23 |
| Rhipicephalus MicroPlus | GST, убиквитин, селенопротеина, Bm86, Bm91, subolesin Г.И., GIII, EF1a, жгутовидные шелковые белка, фон Виллебранда фактор | 16, 18, 25, 27 |
| Rhipicephalus аппиШиз | убиквитин, subolesin, EF1a, GIII | 16 |
Таблица 1. Tick видов, в которых РНК-интерференции протокол был использован.
Рисунок 1. Размещение клещей, вентральной стороной вверх, на двойной клейкой лентой придерживался лист красной стоматологического воска. Клещей помещаются в группы по 5, после чего небольшую полоску клейкой ленты находится над ротовые в целях дальнейшего безопасного клещей, позволяя наблюдать инжектор тело клеща во время инъекции.
Рисунок 2. Инъекции процедура включает в себя (а) пирсинг правом нижнем квадранте тик экзоскелет с инсулином сиRinge оснащен 29 иглу, чтобы создать месте инъекции, (б) немедленное введение дсРНК на этом сайте, используя шприц Гамильтон с 33 иглы которых (с), скорее всего, приведет к некоторой утечке клещей гемолимфы / жидкости.
Рисунок 3. Панели клещей шесть групп, в которых РНК-интерференции был использован для выявления тик защитных антигенов в Amblyomma americanum. Фенотипические изменения у клещей можно увидеть при сравнении с положительным subolesin RNAi контроля и отрицательных связанных контроль дсРНК. В этом эксперименте влияние RNAi в кредит смертности, веса и откладки яиц в каждой группе было статистически проанализированы.
Discussion
Хотя другие методы были описаны для RNAi в 14 клещей, 33, инъекции дсРНК описанная здесь наиболее широко используется как в голодные (табл. 1) и подается клещей 16,25,34. RNAi было показано, что ценный инструмент для исследования клещей функции гена, характеристика клеща возбудителя интерфейс и отбор и характеристика тик защитных антигенов 14,35. В частности, RNAi стал самым ценным инструментом для функционального анализа в клещи 35.
Методологически RNAi, скорее всего, превратится в более эффективных методов, которые могут позволить гена нокдаун в большое количество людей. Механизм дсРНК вызванные РНК-интерференции в тиках следует доработать, чтобы способствовать лучшему пониманию и использованию этого генетического подхода у этого вида 35,36. Степень вне целевой эффекты RNAi в тактах также важный вопрос, который должен быть полностью рассмотрены 14,27. Наконец, RNAi, скорее всего, обеспечить всестороннюю вклад в изучение клещей регуляции генов и системной биологии и клещей возбудитель интерфейс и может иметь влияние на разработку вакцин для контроля тик заражения и передачи клещевого патогенов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим членов нашей лаборатории для плодотворных дискуссий и технической помощи. Это видео презентация была поддержана заместителем декана по научной и департамент ветеринарной патобиологии, Центр ветеринарной медицинских наук, Государственный университет Оклахомы. Исследование финансировалось Ministerio де Ciencia электронной Innovación, Испания (проект BFU2008-01244/BMC), CSIC очной проекта PA1002451 к JF, Уолтер Р. Sitlington Обладая кафедры пищевых исследований животных на КМК, 2009 CVHS RAC грант, OAES Здоровье животных фондов и Министерства сельского хозяйства США, Национальный исследовательский инициатива Конкурентные Грант, № 2007-04613.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Access RT-PCR system | Promega | A1250 | |
| Purelink PCR purification kit | Invitrogen | K3100-02 | |
| Megascript RNAi kit | Ambion | AM1626M | |
| Red dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72674 | |
| Plastic cups, 1.25 oz and lids | Solo Cup Company, Urbana Ill. | ||
| Fine forceps | Electron Microscopy Sciences | Various | |
| Insulin syringe | Monoject | Fitted with a ½", 29 gauge needle | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 701SN,33/.375”/45DGR | Custom made |
| TriReagent | Sigma | 93289 | |
| iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green | Bio-Rad | 170-8892 | |
| Real-time PCR detection system | Bio-Rad | Several | Please refer to http://www.bio-rad.com/ |
References
- de la Fuente, J. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).
- Peter, R. J. mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future. Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).
- Barker, S. C., Murrell, A. Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names. Parasitol. 129, S15-S36 (2004).
- Willadsen, P. Tick control: Thoughts on a research agenda. Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).
- de la Fuente, J., Kocan, K. M. Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species. Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Cerutti, H. RNA interference: traveling in the cell and gaining functions. Trends Genet. 19, 39-46 (2003).
- Kavi, H. H.
- Mello, C. C., Conte, D. J. r
- Zhou, D. RNA interference and potential applications. Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).
- Ramakrishnan, V. G. Application of RNA interference in tick salivary gland research. J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).
- Aljamali, M. N. RNA interference: applicability in tick research. Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).
- Aljamali, M. N. RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum. Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).
- de la Fuente, J. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
- de la Fuente, J. Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale. Genomics. 90, 712-722 (2007).
- AlmazäN, C. Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations. Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).
- de la Fuente, J. Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).
- Zivkovic, Z. Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale. BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).
- de la Fuente, J. Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin. Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).
- de la Fuente, J. RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens. Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).
- de la Fuente, J. The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction. Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).
- de la Fuente, J. Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference. Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).
- de la Fuente, J. Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference. Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).
- Nijhof, A. M. Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens. Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).
- Kocan, K. M. Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections. Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).
- de la Fuente, J. Evidence of the role of tick subolesin in gene expression. BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).
- Smith, A. The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition. Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).
- Galindo, R. C. Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates. Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).
- Canales, M. Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin. Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).
- Kocan, K. M. Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis. BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).
- Zivkovic, Z. Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks. BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).
- Karim, S. Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA. BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).
- Kocan, K. M. Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA. Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).
- de la Fuente, J. Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies. Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).
- Kurscheid, S. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).
