Summary
Methode voor de enzymatische dissociatie, oppervlakte-etikettering en de zuivering door flowcytometrie van fibro / adipogenic en myogene voorlopercellen uit muizen skeletspieren.
Abstract
Skeletspieren bevat meerdere stamvader populaties van verschillende embryonale oorsprong en ontwikkelingspotentieel. Myogene voorouders, meestal woonachtig in een 'satelliet cel positie "tussen de myofiber plasmamembraan en de laminine-rijke kelder membraan dat ensheaths hij, zichzelf vernieuwen cellen die uitsluitend toegewijd aan de myogene afstamming 1,2. We hebben onlangs beschreef een tweede klasse van het schip verbonden voorouders die kunnen genereren myofibroblasten en witte adipocyten, die inspeelt op schade door efficiënt te voeren proliferatie en biedt ondersteuning aan trofische myogene cellen tijdens weefselregeneratie 3,4. Een van de meest betrouwbare testen aan de ontwikkelings-en regeneratief potentieel van een bepaalde celpopulatie vast te stellen is afhankelijk van hun isolement en transplantatie 5-7. Daartoe hebben we geoptimaliseerde protocollen voor hun zuivering door middel van flowcytometrie van enzymatisch gedissocieerd spier, die zullen we schetsen in dit artikel. De populaties verkregen met behulp van deze methode zal bevatten ofwel myogene of fibro / adipogenic kolonievormende cellen: geen andere soorten cellen in staat zijn uit te breiden in vitro of in vivo overleven levering. Echter, wanneer deze populaties onmiddellijk worden gebruikt na de soort voor moleculaire analyse (bijvoorbeeld qRT-PCR) moet men in gedachten houden dat de vers gesorteerd subsets kunnen andere verontreinigingen cellen die het vermogen van het vormen van kolonies of engrafting ontvangers gebrek bevatten.
Protocol
1. Tissue Collection:
- Gebruik muizen tussen 7 en 12 weken oud. Meestal worden ten minste twee dieren die worden gebruikt: de ene is het instellen van de FACS in een kleur die vereist zijn voor compensatie en voor fluorescentie-min-een isotype controle monsters. De andere is de werkelijke steekproef voor het sorteren.
- Euthanaseren de muizen door de CO 2 inhalatie of volgens een protocol ethiek van de keuze. Plaats muizen op een papieren handdoek, naar boven, en spray met 70% ethanol grondig om verontreiniging te voorkomen met de muis vacht.
- Til de huid in de buikstreek met een tang, maak dan een kleine lengte snijden met scherpe schaar.
- Schil de twee flappen van de huid in tegengestelde richtingen (omhoog en omlaag) volledig bloot achterste ledematen spieren eronder.
- Accijnzen het spierweefsel door het invoegen en uitbreiding van de schaar langs beide zijden van het scheenbeen.
- Herhaal dezelfde procedure voor het dijbeen naar het spierweefsel extract.
- Plaats alle geëxcideerde spierweefsel in 60mm petri-schalen, met behulp van een schotel voor het weefsel van elke muis.
- Herhaal het bovenstaande voor alle muizen.
2. Distantiëren weefsel in enkele cellen door enzymatische digestie:
Gedurende dit deel van het protocol, gebruik steriele reagentia en hulpmiddelen en werken onder steriele omstandigheden.
- Voeg 2 mL van Collagenase II (Sigma, cat # 6885, 500u / ml) en 20 pi van 250mm CaCl 2 voorraad aan elke Petri-schaal.
- Scheur het spierweefsel in kleine stukjes (ongeveer 1 mm 3) met twee tang (een gekartelde, een met twee tanden, van Fine Science Tools, kat # 11051-10, 11154-10), aandacht te verwijderen en gooi zoveel mogelijk verontreinigde niet-spierweefsel mogelijk te maken.
- Dek de Petri-gerechten en incubeer ze op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.
- Haal het Petri-schalen en het gebruik van een 3 ml spuit zuiger grondig mash het weefsel stukken. Gebruik een zuiger voor elk monster aan verontreinigingen te voorkomen.
- Voeg wat (~ 5 ml) steriel koude PBS aan elk Petri-schaal en giet het weefsel slib in een 50 ml Falcon buis (spoel de Petri-schaal indien nodig, om alle weefsel te herstellen)
- Schud de Falcon buis, de buis vullen met PBS, centrifuge @ 800rpm x 5 minuten (Eppendorf bench top Model: 5810R), en zuig het supernatant (herhaal 3 keer)
- Voeg 1 ml mengsel van Collagenase D (Roche, Cat # 11088882001, 1.5u / mL) / Dispase II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / ml) en 10μL van CaCl 2 (250mm) aan elke buis, incuberen bij 37 graden celsius met rotatie gedurende een uur.
- Voeg 5-10 ml van de koude, steriele PBS, vortex en pipet grondig om het weefsel te homogeniseren.
- Vul buizen met PBS en meng goed.
- Breng de vloeistof op een cel 40μm zeef geplaatst op de top van een 50 ml Falcon buis om te filteren op de resterende grote stukken weefsel. Verdeel elk monster gelijkmatig in drie 50ml Falcon buizen. Vul elk van de buizen met PBS dan @ 1600 tpm gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 8 graden Celsius.
- Verwijder het supernatant en verzamelen van cellen voor kleuring.
3. Antilichaam kleuring en sorteren:
Gedurende dit deel van het protocol, gebruik steriele FACS en het verzamelen buffers en werken onder steriele omstandigheden. Commerciële antilichamen worden over het algemeen beschouwd als steriel correct wordt gehanteerd.
- Voor een kleur-en isotype controle monsters, resuspendeer de steekproef in 1 ml FACS buffer en verdeel de geschorste cellen in negen 1,5 ml gelabelde Eppendorf buizen (100 pi elke buis).
- Stel een kleur vlekken vermengt zich volgens de volgende tabel:
LET OP: De uiteindelijke concentratie van isotype controle antilichamen in de vlek moet overeenkomen met dat van het primaire antilichaam zij de controle voor. Bijvoorbeeld, als anti-Sca-1 wordt gebruikt voor een μg/10 6 cellen, moet de overeenkomstige isotype worden gebruikt bij dezelfde concentratie.Tube # Naam van de buis Vennootschap Cat # kloon isotype verdunning 1 Niet-vlek 2 Hoechst33342 sigma B2261 2-5ug/ml 3 PI sigma P4864 1ug/ml 4 CD31-FITC
CD45-FITCeBioscience 11-0311-85 390 Rat IgG2a 500 Huis gemaakt I3 / 2 Rat IgG2b 500 5 Sca1-PECY7 eBioscience 25-5981-82 D7 Rat IgG2a 5000 6 α-7 APC Huis gemaakt R2F2 Rat IgG2b 1000 - Stel isotype controle vlekken vermengt zich met behulp van de volgende tabel:
Tube # Naam
van de buisHoechst PI CD31-
FITCCD45-
FITCSchaalbare-
PE-CY7een-7-
APCRat-
IgG2b-
APCRat-
IgG2a-
pecy7Rat-
IgG2a-
FITCRat-
IgG2b-
FITC7 Iso-
CD31
/ CD45+ + - - + + - - + + 8 Iso-
Schaalbare-
pecy7+ + + + - + - + - - 9 Iso-
α-7-APC+ + + + + - + - - - - Pipet de enkele kleur-en isotopen-controle vlekken mixen (we meestal pas zo aan de concentratie van antilichamen die tussen 5 en 10 pi van verkleuring mix worden toegevoegd aan elk monster) in de juiste eppendorfbuisje van Stap 20. Meng goed en incubeer op ijs gedurende 1 uur.
- Stel een kleur vlekken vermengt zich volgens de volgende tabel:
- Vlek cellen van monster muis met 800μL van het antilichaam cocktail (hieronder) voor FACS celsortering. Meng goed en incubeer op ijs gedurende 1 uur.
Antilichaam cocktail: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC
LET OP: De optimale verhouding van antilichamen tegen cellen moet worden bepaald door individueel te titreren elk antilichaam, omdat er aanzienlijke verschillen kunnen bestaan tussen partijen. De optimale hoeveelheid antilichaam moet worden gebruikt moeten worden uitgedrukt in μgs van antilichamen per 10 6 doelcellen en constant gehouden bij het gebruik van dezelfde partij antilichaam. Het is duidelijk dat, indien het aantal van target cellen geen significante verandering tussen experimenten, of als de kleuring volume wordt geschaald met het aantal cellen, een vaste verdunning van elk antilichaam kan ook gebruikt worden. - Wassen: Voeg ongeveer 1 ml FACS buffer aan elk van de negen controle buizen; Voeg ongeveer 20 ml van FACS buffer om het monster buis.
- Centrifugeer de Eppendorf buisjes @ 3000rpm gedurende 5 minuten (Eppendorf bench top centrifuge, Model: 5417C). Centrifugeer de monsterbuis @ 1600 tpm gedurende 5 minuten (Eppendorf bench top centrifuge, Model: 5810R).
- Zuig Verwijder de bovenstaande vloeistof van alle buizen.
- Resuspendeer cellen in de FACS buffer (1 ml voor elk van de controles, 4ml voor het sorteren sample), om Pipetteer cellen in "FACS buizen" door de cel kap zeef (BD Falcon cat # 352235, 40μm poriëngrootte) te verwijderen resterende klonten die mogelijk invloed op de cytometer.
- Stel de FACS sorter met een enkele kleur controles en isotype controles.
- Verzamel gesorteerd cellen volgens de onderstaande tabel in een 3,5 ml collectie buffer (95% DMEM, 5% FBS) afzonderlijk. Normaal gesproken, bij het oogsten van beide achterste ledematen, kan een enkele wild-type muis opbrengst ongeveer 150.000 myogene progenitor cellen of 100.000 adipogenic progenitor cellen, met de levensvatbaarheid boven de 95%, zoals beoordeeld door reanalyzing gesorteerd cellen door FACS aan het einde van de procedure (zie figuur 1 )
Definitie van myogene en adipogenic voorouders gebaseerd op oppervlakte vlekkenAntilichaam / beits Myogene progenitor (MP) Adipogenic progenitor (AP) Hoechst + + PI - - CD31-FITC - - CD45-FITC - Sca1-PECY7 - + α-7 APC + -
4. Transplantatie:
- Centrifuge gesorteerde cellen @ 1500 tpm gedurende 5 minuten, het supernatant en overdracht cellen te verwijderen om geautoclaveerd Eppendorf buisjes (1,5 ml), spoel cellen met 500 pi van steriele PBS (serum gratis!), Centrifugeer @ 3000rpm gedurende 5 minuten. Behoud van alle reagentia in steriele omstandigheden en het werken in een weefselkweek kap, opnieuw in suspensie myogene voorouders in PBS, of adipogenic stamvader in Matrigel (BD cat # 354234) bij ongeveer 10 6 cellen / ml.
- Transplant myogene voorouders of adipogenic voorlopercellen aan ontvanger muizen.
- Verdoof de muis met isoflouran op basis van uw instelling beleid.
- Scheer het haar rond de injectie regio, dan steriliseren de huid door te wrijven met 70% ethanol
- Injecteer 20μL van myogene voorouders of adipogenic voorouders (= 20K-cellen) met behulp van een 3 / 10 CC insuline spuit (BD cat # 309300).
- Na een juiste tijd (drie weken werkt goed, maar myofibers uitdrukken donor-afgeleide transgene markers zijn meestal binnen een week na transplantatie), verdoven de ontvanger muizen uit stap 29 door intraperitoneale injectie van 400 pi Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 mg / ml), vervolgens transcardially perfuseren met 50ml PBS (bevat 10 uM van EDTA), gevolgd door 15 ml van 4% PFA. Verzamel doelweefsel, post-fix met 4% PFA 's nachts indien nodig, dan' s nachts naar 20% sucrose. Insluiten in oktober, bevriezen en cryosection.
5. Representatieve resultaten:
Wanneer MP worden getransplanteerd in muizen skeletspieren, ze gemakkelijk zekering met reeds bestaande myofibers. Daarom elke genetische label aanwezig is in de donor cellen zullen worden gemakkelijk te detecteren in de vezels die ze ontvangen. Figuur 2 toont een voorbeeld waarbij de getransplanteerde cellen uitgedrukt menselijke alkaline phostphatase, onthulde histochemisch.
Wanneer AP worden getransplanteerd het resultaat is sterk afhankelijk van de omgeving van de transplantatie site: wanneer getransplanteerde subcutaan deze cellen ontstaan geven aan de adipocyten en myofibroblasten (zie figuur 2). In veel andere sites, waaronder de spieren, zij niet overleven tenzij vervetting is veroorzaakt 3.
Figuur 1. Sorteren strategie voor de isolatie van voorlopercellen populaties van skeletspieren (A) Sorteren strategie:. Leefbare cellen werden geïdentificeerd op basis van forward scatter en zijwaartse verstrooiing. Hoechst kleuring werd gebruikt om anuclear puin en propidiumjodide (PI) kleuring uit te sluiten om de dode cellen te sluiten. Hematopoietische (CD45) en endotheel (CD31) cellen werden uitgesloten van de sortering poorten. De α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - scal - deelverzameling bevat alle myogene voorlopers (MP). De schaalbare + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - populatie bevat adipogenic voorlopers (AP). (B) Fluorescentie-minus-een (FMO) isotype controles bevestigen de specificiteit van de vlek. (C) Zuiverheid controles van de MP en AP subsets na sorteren.
Figuur 2. Representatieve resultaten volgende MP en AP transplantatie. AP werden subcutaan getransplanteerd (bovenste paneel) en MP intramusculair (onderste paneel). In beide gevallen, donor cellen zijn afkomstig uit een muis te drukken transgene menselijke alkalische fosfatase, geïdentificeerd door de bruine vlekken.
Discussion
Het doel van dit protocol is om te staken een redelijke balans tussen de hoge opbrengsten en een hoge levensvatbaarheid van het gezuiverde cellen. De meest kritische stap om ervoor te zorgen dat de gezonde cellen worden teruggewonnen is, voorspelbaar, de enzymatische dissociatie van de start weefsel. De behandeling van het weefsel moet worden in het bijzonder zacht, dat is moeilijk aan te tonen of zelfs waarderen in een audiovisuele formaat. Een andere belangrijke factor is de lengte van de procedure. Hoe langer het duurt om van de donor naar de ontvanger dier, hoe lager de levensvatbaarheid en dus de implantatie efficiëntie. Moet er vragen over de levensvatbaarheid dat niet onmiddellijk wordt beantwoord door te kijken naar de frequentie van PI positieve gebeurtenis in het gezuiverde cellen monsters na sortering, stellen we voor dat een beperkte verdunning test om clonogenicity maatregel is 3 uitgevoerd. Typische soorten van onbeschadigde spieren routinematig opbrengst ongeveer 1 in 15-20 cellen die in staat na het begin van myogene of fibro / adipogenic kolonies in vitro. Terwijl in wezen 100% van de kolonies geïnitieerd vanuit Kamerleden bevatten gedifferentieerde myotubes, slechts ongeveer een derde van de kolonies verkregen uit FAPs bevatten adipocyten in aanvulling op gladde spieren actine positieve myofibroblasten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C-6885, | 500 u/ml |
| Collagenase D | Roche Group | 11088882001 | 1.5 u/ml |
| Displace II | Roche Group | 04942078001 | 2.4 u/ml |
| cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40 μm |
| Tube with cell strainer | BD Biosciences | 352235 | 40 μm |
| H–chst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | 2-5 ug/ml |
| CD31-FITC | eBioscience | 11-0311-85 | Clone 390 |
| CD45-FITC | Home made | Clone I3/2 | |
| Sca1-PECY7 | eBioscience | 25-5981-82 | Clone D7 |
| α-7 integrin APC | Home made | Inquire with Rossi lab | R2F2 |
References
- Buckingham, M., Montarras, D.
- Relaix, F., Marcelle, C.
- Joe, A. W. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
- Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell Cycle. 9, (2010).
- Sherwood, R. I. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. , (2008).
- Montarras, D. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
