Summary
Método para la disociación enzimática, el etiquetado de superficie y la purificación por citometría de flujo de fibro / adipogénico y progenitores miogénica del músculo esquelético murino.
Abstract
El músculo esquelético contiene múltiples poblaciones progenitoras de distintos orígenes embrionarios y potencial de desarrollo. Progenitores miogénica, por lo general residen en una "posición de las células satélite" entre la membrana plasmática miofibrilar y la membrana basal laminina-ricos que se ensheaths, se auto-renovación de células que son los únicos comprometidos con el 1,2 linaje miogénico. Recientemente hemos descrito una segunda clase de progenitores buques asociados que pueden generar miofibroblastos y los adipocitos blancos, que responde a los daños causados por la proliferación de entrar de manera eficiente y proporciona soporte trófico de las células miogénica en la regeneración de tejidos 3,4. Una de las pruebas más fiables para determinar el potencial de desarrollo y regeneración de una población determinada célula depende de su aislamiento y el trasplante de 5-7. Con este fin, hemos optimizado los protocolos para su purificación mediante citometría de flujo del músculo disociadas enzimáticamente, que vamos a esbozar en este artículo. Las poblaciones obtenidas con este método se contienen células colonia miogénica o fibro / adipogénico formación: no otros tipos de células son capaces de expandir in vitro o in vivo sobrevivir en la entrega. Sin embargo, cuando estas poblaciones se utilizan inmediatamente después de la clasificación para el análisis molecular (por ejemplo, QRT-PCR) se debe tener en cuenta que los subconjuntos recién ordenados pueden contener otras células contaminantes que carecen de la capacidad de formar colonias o injerto destinatarios.
Protocol
1. Tejido Colección:
- Utilizar ratones de entre 7 y 12 semanas de edad. Por lo general, al menos dos animales se utilizan: uno es la creación de la FACS de un solo color controles necesarios para la compensación y la fluorescencia-menos-uno muestras de control de isotipo. La otra es la muestra real para la clasificación.
- La eutanasia a los ratones por inhalación de CO 2 o de acuerdo con un protocolo de ética de la elección. Ratones lugar en una toalla de papel, mirando hacia arriba, y rociar con etanol al 70% a fondo para evitar la contaminación con la piel del ratón.
- Levante la piel en la región abdominal con una pinza, a continuación, hacer un pequeño corte longitudinal con tijeras afiladas.
- Pelar los dos colgajos de piel en direcciones opuestas (arriba y abajo) para exponer completamente los músculos de las extremidades posteriores por debajo.
- Extirpar el tejido muscular mediante la inserción y la ampliación de las tijeras a ambos lados de la tibia.
- Repita el mismo proceso para el fémur para extraer el tejido muscular.
- Coloque todos los tejidos del músculo extirpado en placas petri de 60 mm, utilizando un plato para el tejido de cada ratón.
- Repita los pasos anteriores para todos los ratones.
2. Disociarse del tejido en células individuales por digestión enzimática:
A lo largo de esta sección del protocolo, utilice los reactivos estériles y las herramientas y el trabajo en condiciones estériles.
- Añadir 2 ml de colagenasa II (Sigma, cat # 6885, 500u / mL) y 20 l de 250 mm de CaCl2 acciones a cada plato de Petri.
- Romper el tejido muscular en trozos pequeños (alrededor de 1 mm 3) con dos pinzas (una sierra, una con 2 dientes, de las herramientas de Ciencias Artes, cat # 11051-10, 11154-10), prestando atención a retirar y desechar lo más contaminadas no tejido muscular como sea posible.
- Cubra la placas Petri y se incuba a 37 grados centígrados en 30 minutos.
- Recuperar el placas Petri y el uso de un émbolo de una jeringa de 3 ml a fondo el puré de trozos de tejido. Use un émbolo para cada muestra para evitar contaminaciones.
- Agregue un poco de (~ 5 ml) PBS estéril fría a cada plato de Petri y la transferencia de los lodos de tejido en un tubo de 50 ml Falcon (enjuagar el plato de Petri, si es necesario para recuperar todo el tejido)
- Agite el tubo Falcon con fuerza, llenar el tubo con PBS, @ 800rpm x 5 minutos (Eppendorf modelo de banco: 5810R), y aspirar el sobrenadante (repetir 3 veces)
- Agregue la mezcla de 1 ml de colagenasa D (Roche, Cat # 11088882001, 1,5 U / ml) / Dispasa II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / mL) y 10μL de CaCl 2 (250 mm) a cada tubo, se incuba a 37 grados C con rotación durante una hora.
- Añadir 5-10 ml de frío, PBS estéril, vortex y pipetear bien para homogeneizar el tejido.
- Llenar los tubos con PBS y mezclar bien.
- Trasvasar el líquido a un filtro de 40μm celular colocado en la parte superior de un tubo Falcon de 50 ml para filtrar el resto de piezas grandes de tejido. Divide cada muestra de manera uniforme en tres tubos de 50 ml Falcon. Llene cada uno de los tubos con PBS y centrifugar @ 1.600 rpm durante 5 minutos a 8 grados centígrados.
- Eliminar el sobrenadante y recoger las células de la tinción.
3. La tinción de anticuerpos y clasificación:
A lo largo de esta sección del protocolo, el uso FACS estéril y tampones de recogida y trabajar en condiciones estériles. Anticuerpos comerciales generalmente se consideran estériles si se maneja adecuadamente.
- De un solo color y las muestras de control de isotipo, volver a suspender la muestra en tampón FACS 1 mL y se dividen las células en suspensión en 1,5 ml nueve pre-etiquetados tubos Eppendorf (100 l cada tubo).
- Establecer manchas de color se mezcla única de acuerdo con la siguiente tabla:
ATENCIÓN: La concentración final de anticuerpos isotipo de control de la mancha debe coincidir con el anticuerpo primario son el control de. Por ejemplo, si el anti-CEC-1 se utiliza para una μg/10 6 celdas, su isotipo correspondiente debe ser utilizado en la misma concentración.Tubo # Nombre del tubo Empresa Cat # clon isotipo dilución 1 No mancha 2 Hoechst33342 sigma B2261 2-5ug/ml 3 PI sigma P4864 1ug/ml 4 CD31-FITC
CD45-FITCeBioscience 11-0311-85 390 IgG2a de la rata 500 Casa hecha I3 / 2 Rata IgG2b 500 5 Sca1-PECY7 eBioscience 25-5981-82 D7 IgG2a de la rata 5000 6 α-7 APC Casa hecha R2F2 Rata IgG2b 1000 - Establecer un control de isotipo tinción mezcla con la siguiente tabla:
Tubo # Nombre
del tuboHoechst PI CD31-
FITCCD45-
FITCEsca-
PE-Cy7A-7-
APCRat-
IgG2b-
APCRat-
IgG2a-
pecy7Rat-
IgG2a-
FITCRat-
IgG2b-
FITC7 Iso-
CD31
/ CD45+ + - - + + - - + + 8 Iso-
Esca-
pecy7+ + + + - + - + - - 9 Iso-
α-7-APC+ + + + + - + - - - - Pipeta de un solo color y la mezcla de isótopos tinción de control (por lo general, ajustar la concentración de anticuerpos, por lo que entre el 5 y 10 l de la tinción de la mezcla se añadió a cada muestra) en la correspondiente tubo Eppendorf a partir del paso 20. Mezclar bien e incubar en hielo durante 1 hora.
- Establecer manchas de color se mezcla única de acuerdo con la siguiente tabla:
- Tinción de las células de ratón muestra con 800μL del cóctel de anticuerpos (abajo) para la clasificación de células FACS. Mezclar bien e incubar en hielo durante 1 hora.
Cóctel de anticuerpos: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC
ATENCIÓN: La relación óptima de anticuerpos contra las células deben ser determinados por titulación individual de cada anticuerpo, como Pueden existir diferencias significativas entre los lotes. La cantidad óptima de anticuerpos que se utilicen deben ser expresados en μgs de anticuerpos por 10 6 células diana y se mantiene constante cuando se utiliza el mismo lote de anticuerpos. Claramente, si el número de células diana no cambia significativamente entre los experimentos, o si el volumen de tinción se escala con el número de células, una dilución fija de cada anticuerpo también puede ser utilizado. - Lavado: Añadir aproximadamente 1 ml de solución tampón FACS para cada uno de los nueve tubos de control, agregar aproximadamente 20 ml de solución tampón FACS para el tubo de muestra.
- Centrifugar el tubos Eppendorf @ 3000rpm durante 5 minutos (centrífuga Eppendorf banco de la top model,: 5417C). Centrifugar el tubo de la muestra @ 1.600 rpm durante 5 minutos (banco de centrifugadora de Eppendorf, Modelo: 5810R).
- Aspirar y desechar el sobrenadante de todos los tubos.
- Resuspender las células en el tampón FACS (1 ml por cada uno de los controles, 4 ml para la muestra de la clasificación), las células con una pipeta en "tubos FACS" a través del filtro celular tapa (gato BD Falcon # 352235, 40μm de tamaño de poro) para eliminar los grupos restantes que pueden afectar el citómetro.
- Establecer el Clasificador de FACS con los controles de un solo color y los controles de isotipo.
- Muestras de células ordenados de acuerdo a la siguiente tabla en un buffer de recolección de 3,5 ml (95% DMEM, 5% de SFB) por separado. Normalmente, cuando se cosecha dos patas traseras, un solo ratón de tipo salvaje podría producir alrededor de 150.000 células progenitoras miogénica o 100.000 células progenitoras adipogénico, con la viabilidad por encima del 95%, a juzgar por volver a analizar las células ordenados por FACS en el final del procedimiento (Figura 1 )
Definición de los progenitores y miogénica adipogénico sobre la base de tinción de la superficieAnticuerpo / mancha Progenitoras miogénica (MP) Progenitoras adipogénico (AP) Hoechst + + PI - - CD31-FITC - - CD45-FITC - Sca1-PECY7 - + α-7 APC + -
4. Trasplante:
- Centrifugar las células ordenados a 1500 rpm durante 5 minutos, eliminar las células sobrenadante y traslado al autoclave los tubos Eppendorf (1,5 ml), lavar las células con 500 l de PBS estéril (suero gratis!), Centrifugar @ 3000rpm durante 5 minutos. Mantener todos los reactivos en condiciones estériles y trabajar en una campana de cultivo de tejidos, resuspender progenitores miogénica en PBS, o progenitoras adipogénico en Matrigel (BD # 354234 gato) en aproximadamente 10 6 células / ml.
- Trasplante de progenitores o progenitoras miogénica adipogénico a los ratones receptores.
- Anestesiar a los ratones con isoflouran de acuerdo con su política de la institución.
- Afeitar el vello de la región de inyección y luego esterilizar la piel por el roce con el 70% de etanol
- Inyectar 20μL de los progenitores o progenitoras miogénica adipogénico (= 20k células) con una jeringa CC 03.10 insulina (gato BD # 309300).
- Después de un tiempo apropiado (tres semanas funciona bien, pero miofibras expresar derivadas del donante marcadores transgénicos son evidentes dentro de una semana después del trasplante), anestesiar a los ratones receptores del paso 29 por inyección intraperitoneal de 400 l Avertin (Sigma Cat. # T04840-2, 25 mg / ml), luego perfundir transcardialmente con 50 ml de PBS (contiene 10 mM de EDTA), seguido por 15 ml de PFA al 4%. Recoger tejido diana, después de arreglar con un 4% PFA durante la noche si es necesario, a continuación, transferir el 20% de sacarosa durante la noche. Insertar en octubre, congelar y cryosection.
5. Los resultados representativos:
Cuando se trasplantan MP en el músculo esquelético del ratón, que fácilmente se fusionan con pre-existentes miofibras. Por lo tanto, cualquier etiqueta genética presente en las células del donante será fácilmente detectable en las fibras que los recibió. La figura 2 muestra un ejemplo donde las células trasplantadas expresado phostphatase alcalinas humanos, reveló histológicamente.
Cuando AP se trasplantan el resultado depende en gran medida el medio ambiente del sitio de trasplante: cuando se trasplantaron estas células por vía subcutánea dan origen a los adipocitos y miofibroblastos (ver figura 2). En muchos otros sitios, incluyendo los músculos, no sobrevivirá a menos que la degeneración grasa ha sido inducido 3.
Figura 1. Clasificación de la estrategia para el aislamiento de las poblaciones progenitoras de músculo esquelético (A) La estrategia de clasificación:. Las células viables fueron identificados sobre la base de dispersión hacia adelante y dispersión lateral. Tinción Hoechst se utilizó para excluir los residuos anucleadas y tinción con yoduro de propidio (PI) para excluir a las células muertas. Hematopoyéticas (CD45) y células endoteliales (CD31), las células fueron excluidos de las puertas de la clasificación. El α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - Scal - subconjunto contiene todos los progenitores miogénica (MP). El Scal + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - población contiene progenitores adipogénico (AP). (B) de fluorescencia-menos-uno (FMO) controles de isotipo confirmar la especificidad de la mancha. (C) Pureza cheques de subconjuntos MP y AP después de la clasificación.
Figura 2. Los resultados representativos siguientes MP y el trasplante de AP AP. Fueron trasplantados por vía subcutánea (arriba) y MP por vía intramuscular (panel inferior). En ambos casos, las células del donante se originó a partir de un ratón transgénico que expresa la fosfatasa alcalina humana, identificados por la coloración marrón.
Discussion
El objetivo de este protocolo es establecer un equilibrio razonable entre alto rendimiento y alta viabilidad de las células purificadas. El paso más crítico para asegurar que las células sanas se recuperan es, como era previsible, la disociación enzimática del tejido de partida. El manejo de los tejidos deben ser especialmente cuidadoso, lo cual es difícil de demostrar o aprecia incluso en un formato audiovisual. Otro factor clave es la duración del procedimiento. Cuanto más tiempo se tarda en ir desde el donante hasta el receptor de los animales, menor será la viabilidad y por lo tanto, la eficiencia de injerto. Si hubiera alguna duda sobre la viabilidad de que no es inmediatamente contestada por mirar a la frecuencia de eventos PI positivos en las muestras de células purificadas después de la clasificación, se sugiere que un ensayo de dilución límite para medir clonogenicidad se lleva a cabo 3. Clase típica de los músculos en buen estado habitualmente producen alrededor de un 15-20 en células capaces de iniciar colonias miogénica o fibro / adipogénico in vitro. Mientras que prácticamente el 100% de las colonias de los diputados iniciaron contienen miotubos diferenciados, sólo una tercera parte de las colonias obtenidas a partir de FAP contiene adipocitos, además de suave miofibroblastos actina de músculo positivo.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C-6885, | 500 u/ml |
| Collagenase D | Roche Group | 11088882001 | 1.5 u/ml |
| Displace II | Roche Group | 04942078001 | 2.4 u/ml |
| cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40 μm |
| Tube with cell strainer | BD Biosciences | 352235 | 40 μm |
| H–chst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | 2-5 ug/ml |
| CD31-FITC | eBioscience | 11-0311-85 | Clone 390 |
| CD45-FITC | Home made | Clone I3/2 | |
| Sca1-PECY7 | eBioscience | 25-5981-82 | Clone D7 |
| α-7 integrin APC | Home made | Inquire with Rossi lab | R2F2 |
References
- Buckingham, M., Montarras, D.
- Relaix, F., Marcelle, C.
- Joe, A. W. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
- Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell Cycle. 9, (2010).
- Sherwood, R. I. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. , (2008).
- Montarras, D. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
