Summary
Metod för enzymatisk dissociation, yta märkning och rening med flödescytometri av fibro / adipogenic och myogenic stamceller från mus skelettmuskulaturen.
Abstract
Skelettmuskulatur innehåller flera föregångare populationer av olika embryonala ursprung och utvecklingspotential. Myogenic progenitorceller, vanligtvis bosatt i en "satellit cell position" mellan de myofiber plasmamembranet och laminin-rika basalmembranet att ensheaths det, är egna förnyar celler som endast har åtagit sig att myogenic härstamning 1,2. Vi har nyligen beskrivit en andra klass av fartyg tillhörande stamceller som kan generera myofibroblaster och vita fettceller, som svarar för skada genom att effektivt in spridning och ger trofiska stöd till myogenic celler under vävnadsregenerering 3,4. En av de mest betrodda analyser för att fastställa utvecklings-och regenerativ potentialen hos en viss cell befolkning är beroende av deras isolering och transplantation 5-7. För detta ändamål har vi optimerat protokoll för deras rening genom flödescytometri från enzymatiskt dissocierade muskel, som vi kommer att beskriva i denna artikel. De populationer som erhålls med denna metod kommer att innehålla antingen myogenic eller fibro / adipogenic kolonibildande celler: inga andra celltyper kan expandera in vitro-eller efterlevande in vivo leverans. Men när dessa populationer används omedelbart efter den typ av molekylär analys (t.ex. QRT-PCR) måste man hålla i minnet att den nyligen sorteras delmängder kan innehålla andra främmande celler som saknar förmågan att bilda kolonier eller engrafting mottagare.
Protocol
1. Tissue Collection:
- Använd möss mellan 7 och 12 veckor gamla. Vanligtvis är minst två djur som används: en är att ställa in FACS enfärgad kontroller som krävs för ersättning och för fluorescens-minus-en isotyp kontrollprov. Den andra är den verkliga provet för sortering.
- Euthanize mössen av CO 2 inandning eller enligt en etisk protokoll val. Placera möss på en pappershandduk, uppåt och spraya med 70% etanol noggrant för att undvika kontaminering med musen päls.
- Lyft huden i buken regionen med pincett, sedan göra en liten längsgående snitt med vass sax.
- Skala två flikar av hud i motsatt riktning (upp och ner) för att helt avslöja bakbenen musklerna under.
- Excise muskelvävnaden genom att föra in och förlängning av sax längs båda sidor av skenbenet.
- Upprepa samma process för lårbenet för att extrahera muskelvävnad.
- Placera alla censurerade muskelvävnad i 60mm Petri-rätter, med hjälp av en maträtt för vävnad från varje mus.
- Upprepa ovanstående för alla möss.
2. Dissociera vävnad till enskilda celler genom enzymatisk spjälkning:
Under hela denna del av protokollet, använd sterila reagenser och verktyg och arbeta under sterila förhållanden.
- Tillsätt 2 ml kollagenas II (Sigma, katt # 6885, 500U / mL) och 20 mikroliter av 250mm CaCl 2 lager till varje Petri-skål.
- Riv muskelvävnaden i små bitar (ca 1 mm 3) med två peang (en tandad, en med två tänder, från Fine Science Tools, katt # 11.051-10, från 11.154 till 10), att uppmärksamma att ta bort och kassera så mycket förorenade icke-muskelvävnad som möjligt.
- Täck Petri-rätter och inkubera dem vid 37 grader i 30 minuter.
- Hämta Petri-rätter och använd en 3 ml sprutkolven att grundligt mosa vävnaden bitar. Använd en kolv för varje prov för att undvika föroreningar.
- Lägg till några (~ 5 ml) sterilt kalla PBS till varje Petri-skålen och överför vävnaden slam till ett 50mL Falcon röret (spola Petri-skålen om det är nödvändigt att återkräva alla de vävnaden)
- Skaka Falcon röret kraftigt, fyll röret med PBS, centrifugera @ 800rpm x 5 minuter (Eppendorf bänk Modell: 5810R) och aspirera supernatanten (repetera tre gånger)
- Tillsätt 1 mL blandning av kollagenas D (Roche, Cat # 11088882001, 1.5u / mL) / Dispase II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / mL) och 10μL av CaCl 2 (250mm) till varje rör, inkubera vid 37 grader Celsius med rotation i en timme.
- Tillsätt 5-10 ml kall, steril PBS, virvel och pipettera noggrant för att homogenisera vävnaden.
- Fyll rören med PBS och blanda väl.
- Överför vätskan till ett 40μm cell sil placerad på toppen av en 50 ml Falcon rör för att filtrera bort de återstående stora bitar av vävnad. Dela varje prov jämnt i tre 50mL Falcon rör. Fyll varje rör med PBS centrifugera sedan @ 1600rpm i 5 minuter vid 8 grader Celsius.
- Kasta bort vätskefasen och samla in celler för färgning.
3. Antikropp färgning och Sortering:
Under hela denna del av protokollet, använd sterila FACS och buffertar insamling och arbete under sterila förhållanden. Kommersiella antikroppar anses i allmänhet sterila om det hanteras rätt.
- För enfärgade och isotyp kontrollprover, resuspendera provet i 1 mL FACS buffert och dela den avstängda cellerna i nio 1,5 mL pre-märkta Eppendorf-rör (100 mikroliter varje rör).
- Sätt upp enda färg färgning blandar enligt följande tabell:
OBS: Den slutliga koncentrationen av isotypisk kontroll antikroppar i fläcken ska matcha som den primära antikroppen de är kontroll. Till exempel, om anti-Sca-1 används för 1 μg/10 6 celler, måste dess motsvarande isotypisk användas vid samma koncentration.Rör # Namn på tub Företag Katt # klon isotyp utspädning 1 Icke-bets 2 Hoechst33342 sigma B2261 2-5ug/ml 3 PI sigma P4864 1ug/ml 4 CD31-FITC
CD45-FITCebioscience 11-0311-85 390 Rat IgG2a 500 Hus gjort I3 / 2 Rat IgG2b 500 5 Sca1-PECY7 ebioscience 25-5981-82 D7 Rat IgG2a 5000 6 α-7 APC Hus gjort R2F2 Rat IgG2b 1000 - Sätt upp isotypisk kontroll färgning blandar med hjälp av följande tabell:
Rör # Namn
av rörHoechst PI CD31-
FITCCD45-
FITCSkalbar-
PE-CY7en-7-
APCRat-
IgG2b-
APCRat-
IgG2a-
pecy7Rat-
IgG2a-
FITCRat-
IgG2b-
FITC7 Iso-
CD31
/ CD45+ + - - + + - - + + 8 Iso-
Skalbar-
pecy7+ + + + - + - + - - 9 Iso-
α-7-APC+ + + + + - + - - - - Pipettera den enda färg och isotop blandar kontroll färgning (vi vanligtvis justera koncentrationen av antikroppar, så att mellan 5 och 10 mikroliter av färgning blandning tillsätts varje prov) i rätt Eppendorf-rör från steg 20. Blanda väl och inkubera på is i 1 timme.
- Sätt upp enda färg färgning blandar enligt följande tabell:
- Färga celler från prov musen med 800μL av antikroppen cocktail (nedan) för FACS cell sortering. Blanda väl och inkubera på is i 1 timme.
Antibody cocktail: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC
OBS: Det optimala förhållandet mellan antikroppar mot celler måste bestämmas av individuellt titrera varje antikropp, som betydande skillnader kan förekomma mellan partier. Den optimala mängd antikroppar som ska användas bör uttryckas i μgs av antikroppar per 10 6 målceller och hålls konstant när man använder samma parti antikroppar. Klart, om antalet målceller förändrar inte signifikant mellan experiment, eller om färgningen volymen skalas med antalet celler, kan en fast spädning av varje antikropp också användas. - Tvätt: Tillsätt ungefär 1 mL FACS buffert i varje av de nio kontroll rören, tillsätt ca 20 ml av FACS buffert i provröret.
- Centrifugera Eppendorf-rör @ 3000rpm i 5 minuter (Eppendorf bänk centrifug, Modell: 5417C). Centrifugera provröret @ 1600rpm i 5 minuter (Eppendorf bänk centrifug, Modell: 5810R).
- Aspirera och kassera supernatanten från alla rör.
- Resuspendera celler i FACS buffert (1 ml för varje kontroller, 4ml för sortering prov), till pipett celler till "FACS rör" genom cellen sil locket (BD Falcon katt # 352.235, 40μm porstorlek) ta bort återstående klumpar som kan påverkar cytometern.
- Ställ in FACS Sorter med enfärgade kontroller och kontroller isotyp.
- Samla sorteras celler enligt följande tabell i ett 3,5 ml samling buffert (95% DMEM, 5% FBS) separat. Normalt när skörd båda bakbenen, kunde en enda vild typ mus ger ca 150.000 myogenic stamceller eller 100.000 adipogenic progenitorceller, med bärkraft över 95%, som bedöms av koksaltlösning sorterade celler genom FACS i slutet av förfarandet (Figur 1 )
Definition av myogenic och adipogenic stamceller baserade på ytan fläckarAntikropp / bets Myogenic stamceller (MP) Adipogenic stamceller (AP) Hoechst + + PI - - CD31-FITC - - CD45-FITC - Sca1-PECY7 - + α-7 APC + -
4. Transplantation:
- Centrifugera sorteras celler @ 1500rpm i 5 minuter, avlägsna supernatanten och överför celler autoklaveras Eppendorf-rör (1,5 ml), skölj celler med 500 mikroliter sterilt PBS (serum är gratis!), Centrifugera sedan @ 3000rpm i 5 minuter. Att upprätthålla alla reagenser i sterila förhållanden och arbetar i en vävnadsodling huva, återsuspendera myogenic stamceller i PBS, eller adipogenic progenitorceller i Matrigel (BD katt # 354.234) på ca 10 6 celler / ml.
- Transplant myogenic stamfäder eller adipogenic stamfader till mottagare möss.
- Bedöva musen med isoflouran enligt din institution politik.
- Raka håret runt injektionsstället regionen och sterilisera huden genom att gnugga med 70% etanol
- Injicera 20μL av myogenic stamceller eller adipogenic stamceller (= 20k celler) med en 3 / 10 spruta CC insulin (BD katt # 309.300).
- Efter en lämplig tid (tre veckor fungerar bra, men myofibers uttrycker givare som härrör från transgena markörer uppenbarar sig vanligen inom en vecka efter transplantationen), söva mottagaren möss från steg 29 efter intraperitoneal injektion av 400 mikroliter Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 mg / ml), sedan BEGJUTA transcardially med 50mL PBS (innehåller 10 mikroM av EDTA) först, följt av 15 ml 4% PFA. Samla målvävnaden, post-fix med 4% PFA över natten om det behövs och sedan överföra till 20% sackaros natten. Bädda in i oktober, frysa och cryosection.
5. Representativa resultat:
När MP transplanteras in i musen skelettmuskulaturen, säkring man lätt med redan existerande myofibers. Därför är alla genetiska etikett som finns i givaren cellerna kommer att vara enkelt kan upptäckas i fibrer som tog emot dem. Figur 2 visar ett exempel där de transplanterade cellerna uttryckt mänskliga alkaliska phostphatase avslöjade histochemically.
När AP transplanteras resultatet är starkt beroende av miljön för transplantation webbplats: när transplanterade subkutant dessa celler ger ursprung till adipocyter och myofibroblaster (se figur 2). I många andra platser, inklusive muskler, överlever de inte om fettdegeneration har inducerad 3.
Figur 1. Sortering strategi för isolering av stamceller populationer av skelettmuskulatur (A) Sortera strategi. Livskraftiga celler identifierades baserat på Forward Scatter och Side Scatter. Hoechst färgning användes för att utesluta anuclear skräp och propidiumjodid (PI) infärgning att utesluta döda celler. Hematopoetiska (CD45) och endotelceller (CD31) celler uteslöts från sortering grindar. Den α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - skalbar - delmängd innehåller alla myogenic stamceller (MP). Den skalbar + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - befolkningen innehåller adipogenic stamceller (AP). (B) Fluorescens-minus-en (FMO) isotyp kontroller bekräftar specificiteten av fläcken. (C) renhet kontroller av MP och AP delmängder efter sortering.
Figur 2. Representativa resultat efter MP och AP transplantation. AP var transplanterade subkutant (övre panelen) och MP intramuskulärt (nedre panelen). I båda fallen donator celler härstammar från en mus som uttrycker transgen mänskliga alkaliskt fosfatas, som identifieras med bruna fläckar.
Discussion
Målet med detta protokoll är att finna en rimlig balans mellan hög avkastning och hög lönsamhet för det renade celler. Det mest kritiska steget i att se till att friska celler återvinns är förutsägbart, den enzymatiska dissociation av vävnad. Hanteringen av vävnaden bör vara särskilt försiktig, vilket är svårt att påvisa eller uppskatta även i ett audiovisuellt format. En annan viktig faktor är längden på förfarandet. Ju längre tid det tar att gå från givare till mottagare djuret, desto lägre livskraft och därför engraftment effektivitet. Skulle det finnas några frågor om lönsamheten som inte omedelbart besvaras genom att titta på frekvensen av PI positiv händelse i det renade cellprover efter sortering föreslår vi att en begränsning av utspädning test för att mäta clonogenicity utförs 3. Typiska sorter från oskadad muskel ger rutinmässigt ungefär 1 på 15-20 celler kan initiera myogenic eller fibro / adipogenic kolonier in vitro. Medan huvudsak 100% av kolonierna initieras från riksdagsledamöter differentierade myotubes, bara ungefär en tredjedel av kolonier från FAPs innehåller adipocyter förutom att jämna positiva muskler aktin myofibroblaster.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C-6885, | 500 u/ml |
| Collagenase D | Roche Group | 11088882001 | 1.5 u/ml |
| Displace II | Roche Group | 04942078001 | 2.4 u/ml |
| cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40 μm |
| Tube with cell strainer | BD Biosciences | 352235 | 40 μm |
| H–chst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | 2-5 ug/ml |
| CD31-FITC | eBioscience | 11-0311-85 | Clone 390 |
| CD45-FITC | Home made | Clone I3/2 | |
| Sca1-PECY7 | eBioscience | 25-5981-82 | Clone D7 |
| α-7 integrin APC | Home made | Inquire with Rossi lab | R2F2 |
References
- Buckingham, M., Montarras, D.
- Relaix, F., Marcelle, C.
- Joe, A. W. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
- Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell Cycle. 9, (2010).
- Sherwood, R. I. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. , (2008).
- Montarras, D. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
