Summary
このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。
Abstract
既存の神経回路に前駆細胞、神経芽細胞の遊走、だけでなく、新たな神経細胞の分化と統合の増殖：出生後の脳における神経新生は、3つの生物学的事象のメンテナンスに依存します。嗅球における出生後の神経新生のために、これらのイベントは3つの解剖学的に別個のドメイン内で分離されています：増殖は主に神経芽細胞は吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を横断し、新しい神経細胞が分化し、移行、側脳室の上衣ゾーン（SEZ）で発生嗅球（OB）内に統合する。三つのドメインは、はっきりと生物学的事象の各々を調節する、細胞の分子、および生理学的メカニズムを研究する理想的なプラットフォームとして機能する。このホワイトペーパーでは、細胞外の条件が密接に神経芽を移行するための生体内環境で模倣した生後脳組織に最適化された器官スライスアッセイを、説明しています。私たちは、アッセイは、RMS内神経芽細胞の、均一な指向、そしてスピーディな動きを提供することを示している。このアッセイは、異なる遺伝的背景の上にマウスからのクロス移植のアプローチを利用することにより、ニューロン移動の細胞自律的で、非自律的規制の研究のために非常に適したものとなる。
Protocol
I.手続
次のような手法は、滅菌のツールを使用して、層流フードで、無菌条件下で実行する必要があります。
器官型スライス用ガラスボトムディッシュの準備
- 料理は、無菌環境で製造し、滅菌のツールを使用している必要があります。
- スライス培地の150μLドロップは（レシピを参照）培地中の気泡を避けるために注意して皿のガラス底の部分の中央に配置されます。
- 23ゲージの針が装備さ使い捨て注射器で、接着剤（ゴムのり - エルマーの、猫＃E904）の複数のスポットは、気が動転片側を残しながら、培養皿の中心を占めている円形のカバースリップに隣接する正方形の縞に配置されています流体の交換のための（図1）。接着剤の記載されているタイプは、このプロトコルに適用され、スライスや細胞に有毒ではありません。ケアは、これはに衝突し、後でスライスのイメージングを遮るのでガラスカバースリップ上の任意の接着剤を配置するのを回避するために与えられなければならない。 nucleopore膜（直径25ミリメートル、孔径8.0μm - ワットマン、猫＃110614）、所定の位置に固定する接着剤のスポットを使用して、ガラスのカバースリップの上に配置されます。空気の泡がガラスのカバースリップと膜の間に閉じ込めていないことを確認しながらこれは、マイクロ鉗子を使用して実行する必要があります。
- 膜の上に1 mLのスライスの培地を追加。皿を使用する準備ができるまで、30分間後、氷上でインキュベーター内に配置されます。
出生後早期の脳の抽出
スライスが若い出生後のマウス（P1 - P10）から調製されているときに最良の結果が得られる。
- 子犬はイソフルランまたは他の承認された方法で（過剰投与）末期麻酔する。頭は切れるはさみを使用して迅速な断頭続いて、無菌性を高めるために70％エタノールを噴霧することができます。
- ヘッドは、マイクロ鉗子で下顎をクランプすることにより安定化されている。皮膚は、首から鼻に縦方向に切り出される。頭蓋骨は1が内側と2外側カット（ - 図2A両側にある）ことによって、大槽から始まる縦方向と前方にカットされます。頭蓋フラップが脳から離れて削除されるとケアは、基礎となる皮質組織との接触を最小限に抑えるよう注意が必要です。
- ビブラトーム切片中に組織の安定性を向上させるために、脳の外側、ほとんどの側面は、2つの矢状切断することにより除去される。脳の尾側面も小脳の吻側基底（図2B）で切断することによって除去される。
- 二つの半球は正中裂に沿ってスムーズにカットすることにより分離され、そして二つの半球は、慎重に頭蓋骨の外スクープと（図2C - D）埋め込み型で、下、内側面に配置されます。
ホストの脳のセクショニング
- 埋め込み型の2つの半球は、すぐに溶けた3パーセントの低融点37℃（レシピ参照）に維持されている組織調製緩衝液に溶解したDNAグレードアガロースゲル（フィッシャー、猫＃BP1360 - 100）で覆われている。アガロースのさえ硬化を確保するために水平面上に安定化の2分後、金型は、設定を完了するために氷の上に位置している。
- 半球を含むゲルが設定されると、それは金型から削除され、脳組織の周囲にゲルの2〜3ミリメートル残して、トリミング。
- ゲル包埋組織は、その後、最大内側面と、ビブラトームの試料ディスクに搭載されており、シアノアクリレート系接着剤（クレイジー接着剤または同等品）で固定されている。ケアのみ接着剤の最小量を適用するために取られる必要がある、などのあまりにスライスと移行細胞への毒性を持つことになります。ブロックの側面にあまりにも多くの接着剤はまた、組織の潜在的な損傷を引き起こし、カッティングを妨げるでしょう。
- ディスクは、氷冷組織調製の媒体が充填さビブラトーム試料トレイにインストールされています。
- 組織は、低速から中規模の範囲（使用ビブラトームに左右されるため、最適な結果を得るために独立して決定する必要があります）に設定されているビブラトーム速度で、150μm厚さで切片です。最大に設定したときに私たちの手では、振動周波数が最適です。最初のいくつかのスライスは破棄されることがあります。
- とすぐにRMSを含むスライスを（RMSがSEZからOBに伸びる灰色のU字型構造のような肉眼で見える）ブレードから放出されると、それらは慎重にゲル型からからかわれ、スクープされています小さなマイナスのヘラを使用して。スライスは、スライスの培地（図3A - B）を含有するガラスボトムディッシュのnucleopore膜上に配置されます。 150μm以下でカットするときに典型的な出生後早期のマウスの脳は半球あたり約2〜3 RMSのセクションが得られます。それは彼らは非常に壊れやすいようにスライスを処理すると、最小限に抑えられることが重要です。スライスした料理は、インキュベーターに転送されます。
ドナーの脳セクショニングとRMS移植
- ドナーの脳が（神経芽細胞の移行に蛍光レポーターを発現している頭脳）250μm厚さで切片化され、スライス、氷冷組織調製のバッファに収集されます。
- スライスは、即時に落射蛍光機能を備えた解剖顕微鏡下に置かれている、とRMSを穏やかにマイクロ鉗子を用いて、顕微ている。 One鉗子は、他のは、それがスライスから解放されるまでRMSの周りに小さな切り傷を作るために使用されている間にスライスを安定させるために使用されます。切除したRMSは、移植の前に小さな片（直径約200〜500程度）に切断される。
- nucleoporeフィルター上に配置ホストのスライスを含むガラスボトムディッシュをインキュベータから削除し、解剖顕微鏡下に配置されます。可視光を使用して、RMSを明確に識別され、小さな切開は、RMSの初期セグメントで作られています。
- 20μLの先端装備ピペッターを使用して、単一ドナーRMSの外植片は、ホストRMSで線刻されたサイトに転送されます。外植片は、軽く2組織間の接触を確立するために切開にプッシュされます。この接触が安定して確保するために、外植片は、スライスとnucleopore膜の間にわずかにプッシュされます。
- RMSを持つすべてのホストのスライスが移植されると、料理はセクションが膜にセトリングさせる少なくとも1時間インキュベーターに戻されます。神経芽細胞は、約1-2時間後の外植片からのホストのRMSへの移行を開始する必要があります。
ニューロン移動のタイムラプスイメージング
- ガラスボトムディッシュをインキュベーターから顕微鏡上でインキュベート室（図3C）に転送されます。蛍光神経芽細胞は、0から目的とする分析のタイプに応じて10分までの間隔で撮像することができます。より小さいか2.5分に等しい時に私たちの間隔を設定することにより、個々の神経芽細胞の遊走サイクルの間に例えば我々は、画像細胞骨格の動態を。ただし、移行の方向と速度などの人口動態は、よりよい5〜10分までの間隔でキャプチャされます。目標の選択は、顕微鏡のブランドに応じて大きく変化する。ニコンC1共焦点顕微鏡では、20倍、乾燥レンズ（ニコンパンフルーア、NA 0.75、WD 0.35ミリメートル）我々の分析に最も適していることがわかります。この共焦点システム上で最良の結果を得るには、ピンホールは中規模サイズ（60μm径）に開かれます。最も適切な回遊行動のために、イメージングは少なくとも20ミクロン離れてスライスのカット面のどちらかから、RMSの厚さの奥深くの細胞に限られている。レーザパワーは、それが最小になるように最適化されますが、個々の神経芽細胞の詳細は、表示されたままということがあります。
- 撮影が完了すると、スライスが氷冷で固定し、そして新鮮な4％パラホルムアルデヒドを用意し、免疫染色、さらにイメージングのためのスライド上にマウントすることができます。我々はそのようなラミニンなどの付着基質でコーティング私たちの膜をしませんので、それらが染色バッファーに浸漬されると、スライスは通常、膜から離れて浮く。彼らは150μmの厚さを維持しながら、セクションが撮像される。それは凍結保存し、凍結切片を、元のスライスの薄いセクションを取得するためにクライオスタットを使用することも可能です。しかし、これは染色のアーティファクトの発生率を高めるだけでなく、組織の整合性を変化させることになります。
II。材料/装置
器官型スライス用ガラスボトムディッシュの準備
- 小さなシリンジ（1mL）を
- 23ゲージの針
- Nucleoporeトラックエッチメンブレン - 直径25mmの、孔径8.0μm - ワットマン、猫＃110614
- グラスボトム培養皿 - 35ミリメートルペトリ皿、14ミリメートルマイクロウェル、第1.5カバーガラス - MatTech、猫＃P35G - 1.5 - 14 - C
- ラバーセメント - エルマーの、猫＃E904
- 基礎培地イーグル - ギブコ、猫＃21010
- 1M Hepes緩衝液（pH7.4）
- 1M D -グルコース
- 100mMのCaCl 2で
- 100mMのMgSO 4を
- 1MのNaHCO 3
- のdH 2 O
- L -グルタミン200mmの
- ペニシリン - ストレプトマイシン
脳の抽出および埋込み
- 麻酔薬（イソフルラン、等）
- 電子レンジ
- 低融点アガロース - フィッシャー、猫＃BP1360 - 100
- クレイジーの接着剤 - 猫＃KG585
- ピール-ウェイ使い捨て埋め込み金型（R - 40） - 20mmの深さ、長方形の22mmx40mm - Polysciences、猫＃18646C
脳の切片とRMS移植
- ビブラトーム - ライカVT1000Sとスライスの準備のためのすべてのアクセサリコンポーネント
- 10Xハンクス平衡塩溶液 - ギブコ、猫＃14185
- Microdissecting鉗子＃5 - Roboz、猫＃RS - 4976
- Microspatula - フィッシャー、猫＃21-401-15
- 実体顕微鏡
のタイムラプスイメージング器官型スライス
- 加湿インキュベーター、5％CO 2
- インキュベータ室と長距離作業の目標（0.6のNA以上）を搭載した倒立顕微鏡
III。レシピ
組織の解剖とスライスの準備のための緩衝液（組織調製緩衝液）
| ストック溶液 | ボリューム | 最後のConcetration |
| 10X HBSS | 50 mLの | 1X |
| 1M Hepes緩衝液（pH7.4） | 1.25mlの | 2.5MM |
| 1M D -グルコース | 15 mLの | 30mMの |
| 1MのCaCl 2 | 0.5mLの | 1mMの |
| 1M MgSO 4を | 0.5mLの | 1mMの |
| 1MのNaHCO 3 | 2 mLの | 4MM |
| のdH 2 O | 430.75 mLの |
4で0.2μmのフィルターや店舗℃で滅菌をフィルタリング
器官型スライス、組織移植とイメージングのための培地（スライスの培地）
| ストック溶液 | ボリューム | 最終濃度 |
| 基礎培地イーグル | 35 mLの | |
| 組織調製緩衝液 | 12.9 mLの | |
| 1M D -グルコース | 1.35 mLの | 20mMの |
| L -グルタミン200mmの | 0.25mLを | 1mMの |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | 0.5mLの | 100units / mLのペニシリン及び0.1mg / mLのストレプトマイシン |
4で0.2μmのフィルターや店舗℃で滅菌をフィルタリング
低融点アガロースゲルの調製
低融点アガロースを50 mLコニカルチューブに0.3グラム/ mLの（レシピを参照）で組織調製緩衝液で希釈されています。チューブは、ハイパワーで5〜10秒の単位でマイクロ波処理されています。刻みの数は、総体積に依存し、10 mLの場合、三増分は（10-8-5秒、それぞれ）で十分です。チューブのキャップは、慎重に空気の圧力を解放し、チューブの破裂を避けるために、加熱の増分の間にねじを緩めるれる。チューブの含有量は非常に熱くなるので注意が必要。アガロースが完全に溶解されると、チューブは温度が使用前に安定するまで少なくとも5分間、37℃の水浴中に保持されます。室温に長時間さらさ固めるにはゲルでしょう。これは可能な限り避けなければならないが、初期準備の24時間以内にすぐに使用するために、硬化ゲルを再加熱することができ、再溶融。
器官型スライスで免疫組織化学
共焦点顕微鏡でイメージングに続いて、スライスをPBS中4％ホルムアルデヒドで4℃で一晩固定してもよい。セクションは、1％トリトンXと10％ヤギ血清で、4℃で一晩ブロックされます（シグマ、カタログ番号S26 - 36 - 23）PBSで4℃で一次抗体と一晩インキュベートした蛍光タグ付きヤギ二次抗体を可視化（全希釈1:1000、室温で1時間インキュベーション）に使用されます。標識されたスライスは、徹底的に、氷冷PBSで前のスライドガラスにマウントして封入することで5〜6回洗浄する。
IV。代表的な結果
私たちの器官スライス培養プロトコルは徹底的にテストされ、移行のパターンと方向の一貫性を保つために、最後の数年間に最適化されています。赤色蛍光タンパク質、TD -トマト、の発現がネスチンのプロモーター（ネスチン- TDのトマト）で誘導されたマウスから得た外植片からアメリカに移住し、細胞の分析は、（ホストRMSにtdTomato +神経芽細胞の高配向と迅速な移行を明らかに図4A）。高倍率タイムラプス解析では、20分間のイメージングセッション（図4B）中に移行する神経芽細胞の全体の長さの優れた分解能を示しています。
ドナーとスライスTD -トマト+細胞を固定し、RMS内の異なる細胞成分に対して免疫染色を行った。 GFAP +アストロサイトとCD31 +の血管は、蛍光免疫組織化学（図5A）を用いて明らかになった。細胞骨格タンパク質のアクチンとチューブリンのために染色したスライスの高倍率の分析は、移行の最中（図5B）の細胞でこれらの成分の不均一な発現を明らかにする。
で使用される抗体これらの例：ウサギ抗- RFP（アブカム、1:250）、ウサギ抗GFAP（Dako社、1:1000）、ラット抗CD31（BD Pharmigen、1:100）、マウス抗アクチン（サンタクルス、1： 500）、ウサギ抗チューブリン（シグマ、1:1000）、ヤギ抗マウスCy3標識（Chemicon社、1:1000）、ヤギ抗ウサギAlexaFluor 647（Invitrogen社、1:1000）、ヤギ抗ラットAlexaFluor 488（Invitrogen社、1:1000）、ヤギ抗ウサギAlexaFluor 488（Invitrogen社、1:1000）。
図1。接着剤の器官型スライス用ガラスボトムディッシュの準備。複数のスポットがフィルターの下から培地を交換するためのオープンな一面を残して、皿の円形のガラス底の成分（赤）の周囲に配置されます。スライス培地の150μL滴はガラスのカバースリップの中央に配置されます。に気泡がガラスのカバースリップと膜の間に閉じ込めていないことを確認しながらnucleopore膜（青）はその後、光沢のある面を下にして、適用されます。スライス培地（グレー）の1mlを膜の上に広がっている、と料理が°はC使用前に37℃でインキュベートする。
図2。セクショニングの脳の抽出と準備。 （A）頭蓋骨は、首から鼻（正中線に沿って点線）に頭皮を切開によって公開されます。頭蓋骨は、その後、1は内側と2側面カット（各側に1つ、2A）することによって、大槽から始まる縦方向と前方にカットされます。（B）皮質の外側-ほとんどの側面と中枢神経系の尾側の側面があるビブラトーム切片中に組織の安定性を向上させるために切除。（CD）二つの半球は、前の組織調製緩衝液に溶解3％アガロースゲルのアプリケーションへの埋め込 み型の内側面を下に分離して配置されます。
図3。脳の切片とクロス移植。 （A）ホストの組織は、150μm厚さで切片であり、RMS -を含むセクションは、慎重に冷たいガラスボトムディッシュのnucleopore膜の上に平らに配置されています。（B）ドナーの脳が（RMSで蛍光レポーターを表現する脳）で区分されたもの250μm厚さ、およびスライスを氷冷組織調製のバッファに収集されます。ドナーRMSは、顕微と小さな片に切断される。 20μLの先端装備ピペッターを使用して、個々のRMSの外植片は、ホストRMSで線刻されたサイトに転送されます。（C）インキュベーションの1-2時間後に、皿は共焦点顕微鏡でインキュベーション段階に転送され、移行が捕捉されるタイムラプスイメージングを使用して。顕微鏡写真は典型的なスライスの代表的な低倍率の画像（グレー）です（ドナーマウスのtdTomato + RMSから赤外植片、赤点線がホストのスライスにRMSの概要を説明）、移植後1時間を設定します。
図4。ホストのRMSへの植片からの神経芽細胞の遊走。 （A）ネスチン- tdTomato +神経芽細胞は、（赤）外植片からホストRMS（緑の点線）移植後1時間に移行する。器官型スライスが離れてSEZからとOBに向かって高配向性と迅速な方法で移動する。（B）渡り鳥サイクルが約上の神経芽細胞のハイパワーのタイムラプス画像で観察することができるホストのRMSを侵入tdTomato +細胞20分周期。スケールバー=10μmである。
図5。器官型スライスの免疫組織化学的評価。植神経芽細胞（赤）は、移行の真っ只中に修正されて12時間後に移植。（A）スライスの蛍光免疫組織化学的染色ではCD31 +の血管を（緑）GFAP +アストロサイトの密度の高いプール（青）を明らかにし、散乱ホストのスライスのRMS内。（B）孤立tdTomato +ホストの移行細胞（赤色）の細胞骨格は、RMSは、アクチン（青）とチューブリン（緑）に対する抗体を用いた共免疫染色により明らかにされる。
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Discussion
RMSの神経細胞の移動は、嗅球1の出生後の神経新生の重要なコンポーネントです。 RMSを介しての移行は、脳の表面への接平面で発生します。接線方向に移行する神経芽細胞が放射状にその前駆細胞のソースの場所だけでなく、彼らの最終的な神経の製品1、2、3の分岐運命に基づいて細胞の移行とは別個のものである。出生後のRMSでの接線方向に移行し細胞の比較的純粋な人口は、この解剖学的に定義可能な地域接線マイグレーションの機構を研究するための最適なプラットフォームになります。ニューロン移動の細胞および分子メカニズムを解読することは、多くの神経疾患（例えば、文献4）を理解するために重要です。この知識は、さらに（例えば、文献5）脳の腫瘍の形成と普及の基礎となるメカニズムの同定を容易に、そして将来の神経交換戦略の傷害または神経変性の部位に再プログラム神経芽細胞の誘導に不可欠である可能性があります。
ここ数年で大きな進歩にもかかわらず、遺伝子や分子ニューロン移動のメカニズム、および特定の細胞内のイベントへのリンクの現在の理解は断片化されたままになります。この追求にheadwaysすることが困難の多くは、胚の脳におけるRMSおよびその他の移行の流れで移行のメカニズムについての間接的な推論を描画するために使用されている組織の固定および免疫組織化学、上のほとんどの移行研究の依存するためです。時間分解能はそのような細胞移動と非常に動的なプロセスを理解するための重要な要件であるのに対し、それが唯一、セルのスナップショットを提供するので、"固定"のアプローチが最適とは言えません。いくつかの洞察力の研究は、我々のプロトコルで使用されるものと同様の片は、細胞外マトリックスの構成要素（例えば、文献6、7）でコーティングされたプラスチックまたはガラス基板上に播種されるというin vitroの方法で使用して細胞移動のメカニズムに取り組んでいる。このアッセイを利用した研究では、移行の明確な役割とメカニズムの数を特定しているものの、 生体条件下での調査結果の妥当性は不明である。さらに最近では、繊維質の共焦点顕微鏡やMRIを使用することにより、神経芽細胞のin vivoイメージングの直接の8-10を行われている。しかし、このような技術は、低解像度の画像を得ることができますので、ニューロン移動の細胞内局在の評価には不十分である。別のアプローチ、アルバレス- Buylla群11によって考案された全載標本は、上衣下幹細胞のニッチ12-14調節に重要な生理的な洞察を生成するために利用されている。まだ、このエレガントなアプローチは、RMSの神経芽細胞の遊走を研究するために利用することはできない。胎児の脳の15と出生後のRMSの移行の分析のために器官のスライスを利用する以前のレポートは16-18を発表されている。我々はこのアプローチを完成させ、ここに高解像度でのRMSのハイスループット向きの記録、速度、および移行の内と細胞間のダイナミクスを可能にするプロトコルを提供している。
提示プロトコルは練習、忍耐、そして準備と結果の分析の両方に専用の時間を必要とするいくつかの課題があります。下記の提案は、このプロトコルを実施するとともに支援します。
- 我々の経験では、P10にP1の年齢の範囲内のマウスは、最良の結果を提供しています。ドナーとレシピエントの脳の間に年齢マッチングは、また実験の再現性を向上させます。
- ほとんどの試薬および培養皿を新しく調製する必要があるため、私たちのスライスのアッセイは、1日で中断のない準備と撮影の数時間を必要とします。脳が収穫されるとそれに伴う手順はできるだけ速く実行する必要があります。
- 断頭とスライスの準備の間に、すべてのステップは、氷冷試薬を使用して実行する必要があります、そして組織の操作は、解剖学的混乱を避けるために最小限に抑える必要があります。
- これらの解剖のために使用ツールは、無菌であると生きている組織の操作のみのために予約してください。ホルムアルデヒドなどの固定液と接触してこれまでにあったツールを利用しないでください。
- スライスは24と36時間の間移動速度と方向に目に見える減少で、最大36時間のために一般的に実行可能です。あなたの実験と解析を計画する際に、この制限に注意してください。
我々の知る限りでは、提示さ器官スライスのアッセイは、OBにSEZから神経芽細胞の遊走の遺伝的および分子メカニズムを解読するための最良の現在のアプローチを提供しています。識別をリンクするために、将来の実験では、RMS 19シグナル伝達ネットワークの発現に関する新たな情報を与えニューロン移動のシグナル伝達カスケードは、大規模な私たちのアッセイの恩恵を受ける。我々は最近、18、20を実証しているとしても、捜査官は、非自律的に移動の調節にケモカインと分泌因子の役割を評価しながら、我々のプロトコルは、自律神経芽細胞の遊走を調節する可能性がある候補シグナル伝達分子の同定を容易にする。私たちの提示手法が容易に幹細胞移植、樹状/軸索伸長、および発生神経生物学と成体のニューロン新生の他のトピックの全ホストの研究のために変更することができます。
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Disclosures
動物実験は、ノースカロライナ州立大学獣医学の、その大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々はビデオでプロトコルを語るためのダンマホーターに感謝。この作品は、NIHのグラント5R01NS062182、老化研究のためのアメリカ連合からの助成金、およびHTGに授与機関の資金によってサポートされています。
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