Summary
Insect olfactorische systemen bieden unieke mogelijkheden voor het opnemen van geurstof-geïnduceerde responsen in de vorm van electroantennograms (EAG) en enkele sensillum opnames (SSR), die de antwoorden worden samengevat van alle geurstof receptor neuronen (ORNs) gelegen op de antenne en van die ondergebracht in afzonderlijke sensilla, respectievelijk.
Abstract
Insect olfactorische systemen bieden unieke mogelijkheden voor het opnemen van geurstof-geïnduceerde responsen in de vorm van electroantennograms (EAG) en enkele sensillum opnames (SSR), die de antwoorden worden samengevat van alle geurstof receptor neuronen (ORNs) gelegen op de antenne en van die ondergebracht in afzonderlijke sensilla, respectievelijk. Deze benaderingen zijn benut voor het verkrijgen van een beter begrip van insecten chemische communicatie. De geïdentificeerde stimuli kan dan gebruikt worden als lok-en insectwerende middelen in het management strategieën voor insectenplagen.
Protocol
1. Insecten
- Navel orangeworm, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera: Pyralidae) kolonie in ons laboratorium is ontstaan uit motten verzameld amandelbomen in Fresno, CA. Onze insecten kolonie is gehandhaafd in klimaatkamers (Percival Inc, IA) op 28 ± 2 ° C, 75 ± 10% relatieve vochtigheid, en onder h 16:8 (licht: donker) foto's regime.
- Opkomende motten worden dagelijks verzameld, gesekst, en overgedragen aan plastic dozen (669 ml lunchbox, 13 x 13 cm, hoogte, 4,5 cm, Rubbermaid) die met maximaal 10 lagen water geweekt papieren handdoeken (Thirsty Ultra absorberende, 27,9 x 27,9 cm , Safeway). Deksels zijn geperforeerd om luchtcirculatie mogelijk te maken. Deze regeling biedt ~ 100% RV.
- Voor elektrofysiologische metingen maken we gebruik 2-4 dagen oud motten na het ontstaan, die worden gehouden onder hoge luchtvochtigheid.
2. Elektrofysiologische Voorbereiding
- Motten (mannetjes of vrouwtjes) zijn voorzichtig geduwd in een pipet tip (200 pi, USA Scientific Inc), die is afgesneden van de top tot een grote (ca. 2 mm) tip diameter hebben. Een nachtvlinder wordt zachtjes geduwd door de andere kant met een vochtige tissue stub tot de antennes en een deel van de kop uitsteken van de tip.
- Exposed hoofd wordt geïmmobiliseerd door het bedekken van het hoofd met een niet-drogende klei (Claytoon, Van Aken International, CA), waardoor een klein deel van een oog en twee antenne worden blootgesteld. Dit preparaat is geplaatst op een platform van de EAG micromanipulator MP-12 (Syntech, Duitsland) tussen de twee elektroden houders.
- We maken gebruik van glazen elektrode van 1,0 mm borosilicate capillaire buis met gloeidraad (WPI Inc, FL) en trok in een Model P-97 micropipet trekker (Sutter Instruments, CA) om micro-elektroden van minder dan een micrometer tip te verkrijgen. Elektroden zijn terug gevuld met sensillum lymfe beltoon (Kaissling en Thorson 1980). Een elektrode doorboort het blootgestelde oppervlak van het oog onder de microscoop (Leica MZ75) en dient als referentie, terwijl de registratie-elektrode herbergt de twee antennes. Ter bevordering van het contact, zijn distale 1-2 antennale segmenten gesneden voordat het ingebracht in de registratie-elektrode. Voor de opnames signalen van individuele sensilla, hebben we iets te wijzigen deze opstelling waarin de registratie-elektrode wordt gespietst onder de microscoop (Olympus BX51WI; 800x vergroting). Actiepotentialen worden geregistreerd door het plaatsen van het glas elektrode aan de voet van een sensillum. Signalen worden versterkt door een hoge impedantie voorversterker (Syntech, Duitsland) en ingevoerd in een UB-IDAC worden geanalyseerd off-line met AUTOSPIKE software (Syntech, Duitsland). AC signalen zijn band pass gefilterd tussen 100 -10.000 Hz en actiepotentialen worden geëxtraheerd door computer met behulp van een algoritme dat AUTOSPIKE hun piek tot dal amplitudes onderscheidt van lawaai. Reacties van individuele neuronen worden berekend als de toename (of afname) in actie potentiële frequentie (spikes per seconde) over de spontane frequentie.
3. Chemische prikkels en stimulering Protocol
- Chemicaliën van hoogste zuiverheid worden gebruikt. Een belangrijk bestanddeel van de vrouwelijke feromoon blend uit de navel orangeworm, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal werd verkregen van Bedoukian Research Inc, CT. Chemicaliën worden verdund, zijn w / v, met een glas gedistilleerd hexaan om de balans op oplossingen van 10 ug / ul en decadic verdunningen te maken heeft. Een aliquot (10 pi) van een stimulus chemische opgelost in hexaan is geladen op een Whatman filter papieren strip (8x40 mm), wordt het oplosmiddel verdampt door zachtjes te schudden gedurende 10 s onder een afzuigkap en de strip is geplaatst in een 5 ml polypropyleen spuit (BD Spuiten, NJ) waaruit verschillende volumes zijn uitgeworpen. Hexaan alleen en een lege spuit dienen als controle.
- De voorbereiding wordt gehouden in een vochtige luchtstroom die door de Syntech Stimulus controller (CS-55 model Syntech, Duitsland) op 20 ml / sec waaraan een stimulus puls van 4 ml / s wordt toegevoegd voor 500 ms. Signalen zijn opgenomen voor 10 s, te beginnen 2 s vóór het begin van de stimulus puls. Antennale voorbereiding is gestimuleerd met 500 ms puls waarin ca. 2 ml van het gezuiverde lucht uit een 5 ml polypropyleen spuit met de stimulus wordt toegevoegd aan de belangrijkste luchtstroom. Een gat van minstens een min of meer, na een hoge respons, is toegestaan tussen stimulatie.
4. Representatieve resultaten
Antennes van ingehouden motten (figuur 1) gestimuleerd met vrouwelijke feromonen component, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal het genereren van robuuste afhankelijk van de dosis respons (Figuur 2). Deze belangrijke component feromoon lokt ook afhankelijk van de dosis prikkelende reacties van lange trichodea sensilla (Figuur 3A) zoals weergegeven in de sporen van enkele unit opnamen (Figuur 3B).
Figuur 1. Live navel orangeworm mot ingetogen en antenne bloot
load/2489/2489fig2.jpg "alt =" Afbeelding 2 "/>
Figuur 2. Dosis afhankelijk EAG reacties uitgelokt in reactie op (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, een belangrijke vrouwelijke feromoon opdrachtgever.
Figuur 3. Sensilla trichoid bij mannelijke navel orangeworm mot te reageren op (Z, Z) -11,13-hexadecadienal in een dosis-afhankelijke wijze. (A) Antenne van mannelijke navel orangeworm mot is multi-gesegmenteerd en elk segment is versierd met een groot aantal van haar structuren, sensilla. Een scanning electronen microscoop, met details in de inzet (Schaal bars zijn 200 en 50 uM, respectievelijk). (B) Extracellulaire single-unit opnames van een trichoid sensillum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze nieuwe methode ontwikkeld voor het fixeren van een live navel orangeworm mot naar olfactorische signalen te meten heeft bewezen robuust te zijn en zeer betrouwbaar. We routinematig gebruiken deze methode voor het isoleren en het identificeren van nieuwe lokstoffen van natuurlijke gastheer substraten zoals amandelen en pistachenoten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ondersteund door USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, NSF 0918177, en Bedoukian Research Integratie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
