Summary
Sistemi olfattivi degli insetti offrono opportunità uniche per la registrazione di odorizzante-indotto risposte nelle forme di electroantennograms (EAG) e le registrazioni sensillum singolo (SSR), che vengono sommati risposte da tutti i neuroni olfattivi (ORNs) situato sulla antenna e da quelli alloggiati in singole sensilli, rispettivamente.
Abstract
Sistemi olfattivi degli insetti offrono opportunità uniche per la registrazione di odorizzante-indotto risposte nelle forme di electroantennograms (EAG) e le registrazioni sensillum singolo (SSR), che vengono sommati risposte da tutti i neuroni olfattivi (ORNs) situato sulla antenna e da quelli alloggiati in singole sensilli, rispettivamente. Questi approcci sono stati sfruttati per ottenere una migliore comprensione della comunicazione chimica degli insetti. Gli stimoli individuati possono poi essere usati come repellenti o attrattivi sia nelle strategie di gestione per insetti.
Protocol
1. Insetti
- Ombelico orangeworm, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera: Pyralidae) colonia nel nostro laboratorio nasce dalle tarme raccolti da mandorli in Fresno, CA. La nostra colonia di insetti è mantenuto in ambiente camere (Percival Inc, IA) a 28 ± 2 ° C, 75 ± 10% di umidità relativa, e sotto 16:08 h (luce: buio) photo regime.
- Falene emergenti sono raccolte giornalmente, sessuato, e trasferiti a scatole di plastica (669 ml lunchbox, 13 x 13 cm, altezza, 4,5 cm, Rubbermaid) fornita con un massimo di 10 strati di carta assorbente imbevuta d'acqua (Thirsty ultra assorbente, 27,9 x 27,9 centimetri ; Safeway). Copertine sono forati per permettere la circolazione dell'aria. Questa disposizione prevede ~ 100% di umidità relativa.
- Per le misure elettrofisiologiche usiamo 2-4 giorni falene vecchi post emergenza, che sono tenuti sotto umidità elevata.
2. Preparazione elettrofisiologici
- Falene (maschi o femmine) sono leggermente spinto in un puntale (200 microlitri, USA Scientific Inc) che viene tagliata dalla parte superiore per avere una punta di grande diametro (circa 2 mm). Una falena viene delicatamente spinto attraverso l'altra estremità con uno stub umidificata carta velina fino al antenne e parte della testa sporgono dalla punta.
- Testa esposta è immobilizzata da coprire il capo con una non-essiccazione argilla (Claytoon, Van Aken International, CA) lasciando una piccola parte di un occhio e due antenne a vista. Questa preparazione è posto su una piattaforma di micromanipolatore EAG MP-12 (Syntech, Germania) tra le due portaelettrodi.
- Noi usiamo elettrodo di vetro fatta da 1,0 millimetri tubo capillare borosilicato con filamento (WPI Inc, FL) e tirato in un modello P-97 micropipetta estrattore (Sutter Instruments, CA) per ottenere microelettrodi di meno di una punta micrometro. Elettrodi sono tornati pieni di sensillum linfa della suoneria (Kaissling e Thorson 1980). Un elettrodo impala l'area esposta l'occhio al microscopio (Leica MZ75) e serve come riferimento, mentre l'elettrodo di registrazione ospita due antenne. Per facilitare il contatto, distale segmenti 1-2 antenne sono tagliati prima di essere inserito nel elettrodo di registrazione. Per i segnali di registrazioni da sensilli singoli, abbiamo leggermente modificare questa impostazione in cui l'elettrodo di registrazione è impalato sotto il microscopio (Olympus BX51WI; ingrandimento 800x). Potenziali d'azione sono registrati inserendo l'elettrodo di vetro alla base di un sensillum. I segnali sono amplificati da una alta impedenza pre-amplificatore (Syntech, Germania) e inseriti in un UB-IDAC essere analizzati off-line con AUTOSPIKE software (Syntech, Germania). AC segnali sono filtrati passa banda tra 100 -10000 Hz e potenziali d'azione sono estratti da un computer utilizzando un algoritmo AUTOSPIKE che distingue il loro picco-attraverso ampiezze di rumore. Le risposte dei singoli neuroni sono calcolati come l'aumento (o diminuzione) della frequenza del potenziale d'azione (spikes al secondo) rispetto alla frequenza spontanea.
3. Gli stimoli chimici e protocollo di stimolazione
- Prodotti chimici di elevata purezza vengono utilizzati. Una maggiore costituente della miscela feromone femminile dal orangeworm ombelico, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal è stato ottenuto da Bedoukian Research Inc, CT. Le sostanze chimiche sono diluiti, w / v, con vetro-esano distillato di rendere le soluzioni stock diluizioni di 10 mg / mL e decadica sono fatti. Un'aliquota (10 mL) di una sostanza chimica stimolo dissolta in esano viene caricato su un filtro di carta Whatman striscia (8x40 mm), il solvente è evaporato agitando delicatamente per 10 s sotto una cappa aspirante e la striscia è posto in una polipropilene 5 ml siringa (siringhe BD, NJ), da cui vari volumi vengono espulsi. Esano solo e una siringa vuota servire come controllo.
- La preparazione si svolge in un flusso di aria umidificata consegnato dal controller stimolo Syntech (CS-55 modello; Syntech, Germania) a 20 ml / sec per cui un impulso stimolo di 4 è aggiunto mL / s per 500 ms. I segnali sono registrati per 10 s, 2 s di partenza prima dell'inizio dell'impulso di stimolo. Preparazione antenne viene stimolato con 500 ms impulso durante il quale ca. 2 ml di aria purificata da una siringa da 5 ml in polipropilene contenente lo stimolo è aggiunto sul flusso d'aria principale. Un gap di almeno 1 minuto o più, a seguito di reazioni di altezza, è consentito tra stimoli.
4. Rappresentante Risultati
Antenne delle falene contenuta (Figura 1) stimolati con componente feromone femminile (Z, Z) -11,13-hexadecadienal generare risposte robusta dose di dipendenti (Figura 2). Questo componente feromone suscita anche grande dose di risposte dipende eccitatorio a lungo trichodea sensilli (Figura 3A) come mostrato in tracce delle registrazioni singola unità (Figura 3B).
Figura 1. Live ombelico orangeworm falena sobrio e antenna esposti
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Figura 2. Risposte EAG dose-dipendenti suscitato in risposta a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, un costituente importante feromone femminile.
Figura 3. Trichoid sensilli nel maschio ombelico orangeworm falena rispondere a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal in modo dose-dipendente. (A) Antenna del maschio ombelico orangeworm falena è multi-segmentato ed ogni segmento è ornata da un gran numero di capelli come strutture, sensilli. Un microscopio elettronico a scansione, che mostra i dettagli nella inserto (barre di scala sono 200 e 50 micron, rispettivamente). (B) extracellulare singola unità registrazioni da un sensillum trichoid.
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Discussion
Questo nuovo metodo sviluppato per immobilizzare un live falena ombelico orangeworm per misurare i segnali olfattivi ha dimostrato di essere robusto e molto affidabile. Noi abitualmente utilizzano questo metodo per isolare e identificare attrattivi romanzo da substrati ospite naturale come mandorle e pistacchi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Supportato da USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, NSF 0918177, e incorporazione di ricerca Bedoukian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
