Utveckla anpassade kinesisk hamster-host cellprotein analyser med hjälp av akustisk teknik Membran mikropartikelenzymimmunoassay

Summary

Utveckling av anpassade analyser på ViBE plattform för mer känslig, reproducerbar, automatiserad resulterar i komplexa matriser beskrivs. Den universella kassett gör analyser lätt kan anpassas för användning med anpassade analyser. Denna mångsidighet möjliggör snabb utveckling och validering av nya analyser eller automatiserade versioner av befintliga manuella analyser, exemplifierad i denna video.

Abstract

Anpassad testmetoder för unika proteiner är ofta begränsade till tidskrävande manuella metoder för detektion och kvantifiering såsom ELISA eller Western blotting på grund av komplexiteten i utvecklingen på alternativa plattformar. BioScale egenutvecklade Acoustic Membrane mikropartikelenzymimmunoassay (AMMP) teknik gör smörgås immunoanalyser lätt kan utvecklas för användning på ViBE plattformen, som ger bättre känslighet och reproducerbarhet, och automatiserad drift. Som ett exempel, beskriver detta protokoll förfarandet för att utveckla en egen kinesisk hamster-värdcellen Protein (CHO-HCP) analys. De allmänna principer som redovisas här kan följas för att utveckla en mängd olika immunologiska.

En AMMP analys mäter antigen koncentration genom att mäta förändringar i oscillationsfrekvens orsakas av bindningen av mikropartiklar till sensorn för att beräkna. Det består av fyra huvudkomponenter: (1) en patron som innehåller en functionalized åtta Sensorchipet (2) antikropp märkt magnetiska mikropartiklar, (3) hapten taggade antikropp som binder till ytan av functionalized chip (4) prover som innehåller antigen av intresse. BioScale har Biosensor är ett resonant enhet som innehåller åtta olika membran med separata fluidic vägar. Membranen förändringen oscillationsfrekvens svar på massa ansamlas på ytan och denna frekvens förändring används för att kvantifiera mängden tillsatt massa.

För att underlätta användning i en mängd olika immunoanalyser sensorn är functionalized med en anti-hapten antikropp. Analysen specifika antikroppar ändras genom kovalenta konjugering av en hapten tagg till en antikropp och biotin till den andra. Den biotin etikett används för att binda antikroppar till streptavidin kombination magnetiska kulor som, i kombination med hapten-märkta antikroppar, används för att fånga analyten i en smörgås. Komplexet binder till chip genom anti-hapten/hapten interaktion. Vid slutet av varje analys köra sensorerna rengörs med en utspädd syra gör det möjligt sekventiell analys av kolumner från en 96-brunnar.

Här presenterar vi en metod för att utveckla en anpassad CHO-HCP AMMP assay för Bioprocess utveckling. Utveckla AMMP analyser eller ändra befintliga analyser i AMMP analyser kan ge bättre prestanda (reproducerbarhet, känslighet) i komplexa prover och minskad nättid. Protokollet visar steg för utveckling och diskussionsavsnittet recensioner representativa resultat. För en mer ingående förklaring av analysen optimering och parametrar anpassning kontakt BioScale. Detta kit erbjuder allmänna bioprocess utveckling analyser som Återstående Protein A, Produkt titer, och Cho-HCP.

Protocol

1. Mikropartikelenzymimmunoassay Förberedelser

1. Etikett antikroppar med hjälp av Biotin NHS kemi
2. Fastställande av graden av Biotinylation
3. Konjugat Streptavidin Pärlor med biotinylerad antikropp
   1. Resuspendera pärlor i den ursprungliga injektionsflaskan genom att vortexa i 1-2 minuter
   2. Alikvotera önskad volym av pärlor i ett mikrocentrifugrör
   3. Tvätta pärlor 3 gånger med PBST:
      1. Placera röret med pärlor på magneten i 2 minuter
      2. Avlägsna supernatanten genom aspiration med röret på magneten. Var noga med att inte störa pärlor
      3. Ta bort röret från magneten och tillsätt 1 ml PBST
      4. Vortexa i 20 sekunder för att resuspendera kulorna
      5. Centrifugera i 5 sekunder för att ta bort kulorna från den gemensamma jordbrukspolitiken
      6. Upprepa 2.3.1-2.3.5 ytterligare två gånger
   4. Efter det tredje tvätta placera röret på magneten och aspirera PBST
   5. Lägg biotinylerad antikroppar mot kulorna och återsuspendera
   6. Om det behövs föra volym biotinylerad antikroppar upp till 300 mikroliter med PBS. Om antikroppen volymen är redan större än 300 mikroliter inte lägga någon PBS
   7. Inkubera pärla / antikropp, suspension 30 minuter vid RT på vortex shaker eller tub rotator
   8. Tvätta tre gånger med PBST som i steg 3.
   9. Blockera pärlor med biotinylerad BSA
      1. Efter den tredje tvättningen lägga 10 mikrogram / mg biotinylerad BSA, justera volymen till 300 mikroliter med PBS om så behövs, och inkubera med agitation i 30 minuter
   10. Tvätta tre gånger med PBST som i steg 3
   11. Resuspendera pärlor i 100 ìl PBS/0.05% BSA. Natriumazid kan läggas till för långtidsförvaring
4. Med vanliga NHS Fluorescein protokoll fluoresceinate detektorn antikroppen
5. Bestämma graden av Fluorescination

2. HCP - Utveckling

1. Förbered arbetar lösningar:
   1. Fluorescein märkta antikroppar (FL-Ab): De flesta CHO-HCP analyser använder FL-AB till en slutlig koncentration av 400 ng / ml. FL-Ab läggs till som en fjärdedel av den slutliga analysen volym, därför koncentrationen av den arbetande lösningen är 1,6 mikrogram / ml. Bered denna lösning genom att späda flab materiel med BioScale Bead / flab spädningsvätska.
   2. Pärlor: De flesta CHO-HCP analyser använder pärlor på en slutlig koncentration av 2x10 ⁵ pärlor / ml. Den pärlan reagens utgör ¼ av den slutliga analysen volym, därför koncentrationen av den arbetande lösningen är 8x10 ⁵ pärlor / ml. Bered denna lösning genom att späda pärla materiel med BioScale Bead / flab spädningsvätska. Vortexa pärla beståndet väl att se till att alla pärlorna är i suspension innan du tar bort en delmängd.
   3. Löpande buffert: Sammansättningen av den löpande buffert kan behöva optimeras för antikroppar används för att utveckla analysen, men flera CHO-HCP-analyser har utvecklats med 10 mm HEPES buffert, 1% Tween, pH 7,5. BioScale har utvecklat en tillsats för att köra buffert (medföljer Development Kit) som läggs till bufferten till en koncentration på 1% före användning.
2. Späd kalibratorer och prover med BioScale Sample Diluent.

3. ViBE system som inrättats

1. Vrid ViBE Workstation på
2. Anslut systemet försörjning och avfall
3. Prime systemet
4. Sätt in en ViBE Cartridge
5. Dra rören
6. Förbered analys mall genom att fylla i bladet märkt "Sample Setup". BioScale ger möjlighet att ha en analys mallen för varje ViBE Workstation analys. Detta gör att användaren kan redigera och spara specifika anteckningar i "Anteckningar" blad av mallen för olika analyser föra en komplett logg av försöket.
7. Initial analys mall uppställt: Börja med att fylla i tabellen (längst upp till vänster) av koncentrationen olika standarder i analysen i "Sample Setup" blad.
8. Nästa, ange ytterligare information i tabellen till höger om standarder (enkel kolonn Läs Setup Ett Lägg Reagens och två Reagens Lägg inställningar) att uppdra åt ViBE Workstation hur länge prover behöver inkubera, hur mycket volym av reagens som ska överföras , hur länge provet ackumulering måste, och huruvida sensor konditionering och sanering av sonder och patron är nödvändiga, etc
9. Fyll tallriken layouten.
10. Ladda prov / reagenserna till tallrikar. VIBE kommer att ge de volymer som krävs för reagenset plattan. Provvolym kan variera, men i hälften av en total analys volym av 120 mikroliter är en bra startpunkt.
11. Applicera plattan täcker. Ladda plattorna mot arbetsstation däck.
12. Kör analysen startar guiden, gå igenom guiden och starta analysen.

4. Representativa resultat

Figur 1: AMMP Sandwich immunoassay På en ViBE arbetsstation, mäter en AMMP analys antigen koncentration. Signal mäts när pärla-antigen-hapten antikroppar binder till sensorn via hapten / anti-hapten interaktion. Regenerering ger sensorn tillbaka till början staten genom att ta bort immunkomplex.

Figur 2: CHO-HCP AMMP analys kalibreringskurva

Figur 2 ovan är ett exempel på en CHO HCP AMMP Assay kalibreringskurva. Analys kan utföras i prover från hela rening strömmen inklusive reaktor med hög precision och reproducerbarhet.

Figur 3: Protein A AMMP analys kalibreringskurva

Figur 3 är en kalibreringskurva för en återstående Protein A AMMP-analys, som utförs med en VIBE Residual Protein A-analys Kit. Samma monteringssats kan användas för en snabbare analys med en 30 minuters inkubation, eller för mer känsliga resultat och större dynamiskt omfång med en längre inkubationstid utan förlust av precision eller noggrannhet, som båda är vanligen bättre än motsvarande Elisas i användarnas händer

Figur 4: Produkt titer AMMP analys

VIBE Workstation kan även användas för produkter titer test, resultat visas i figur 4. Utförs annorlunda än andra AMMP analyser, kräver denna analys inte prov annan beredning än enkel utspädning, eller pärlor och kvantifiering har verifierats i "ingen centrifugering" prover som innehåller över 10 miljoner celler över ett brett spektrum av viabilitet.

Figur 5: AMMP analys standardkurvan för GST-Gadd34 biomarkör-analys

Visas i figur 5 är en standardkurva av signal som erhållits genom ViBE BioAnalyzer (Panel A) eller AlphaScreen teknik med hjälp av rekombinant GST-Gadd34. Resultat på VIBE plattformen var ungefär en logg känsligare med samma antikroppar. AMMP utnyttjar mätning av färre större partiklar men ändå drar nytta av lösningen fas fånga och upptäckt komplexbildning.

Figur 6: AMMP analys standardkurvan för GST-Gadd34 i tumör prov

I Figur 6 var induktion av Gadd34 från CWR22 implanterad testas i närvaro eller frånvaro av en boronate proteasomhämmaren som analyseras av antingen ViBE BioAnalyzer (panel A) eller AlphaScreen (panel B). VIBE plattformen kunde producera känsliga, reproducerbara resultat i in vivo tumörxenografter medan AlphaScreen signalen släcks var med ökad mikrogram av protein.

Detta exempel visar kraften i AMMP teknik i mycket komplexa prover. På grund av känslig detektion chip och hög effektivitet i magneten nära marker, kan lågt antal av magnetiska mikropartiklar effektivt och reproducerbart bildningen av låga överflöd mål mitt i den komplicerade lyseras cellulära (inklusive lysering reagens) och blod skräp.

Discussion

Ovanstående exempel visar AMMP är mycket känsliga kvantitativa resultat i komplexa prover. Detta resultat, då levereras med den lätthet och kontroll av formatering reagenser i systemet gör det möjligt för en mängd olika applikationer. Dessa ansökningar kan vara specifika för ett mål, som i Gadd34 i tumör, eller generiska för ett spektrum av mål, som i värdcellen protein detektion och kvantifiering i prover som korsar rening strömmen. Den låga omkostnader ViBE plattform kombinerat med hög flexibilitet AMMP ger ett kraftfullt verktyg för att leverera kritiska analyser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads	BioScale		(10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes	New England Biolabs	cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent	BioScale		to dilute beads and FlAb
Sample Diluent	BioScale		to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive	BioScale