Summary
钙是一种在神经系统中无处不在的使者,触发神经递质释放和突触强度的变化。在这里,我们展示了一个加载的Ca 2 +指标到果蝇的神经终端的技术。我们也证明所需设备的制造,并强调技术的成功的关键点。
Abstract
钙在神经系统中的许多角色,但没有更令人印象深刻,作为神经递质释放的触发,并没有比支持学习和记忆的突触可塑性的重要使者深刻。为了进一步阐明的分子基础的Ca 2 +依赖的突触机制,需要一个模型系统,基因可塑性和生理访问。果蝇提供了这样一个模型。在这个系统中,基因编码的荧光指标,可用来检测神经末梢的Ca 2 +的变化。然而,这些指标是有限的敏感性钙+和常常表现出非线性响应。合成荧光指标更适合于测量迅速的Ca 2 +与神经活动有关的变化。在这里,我们展示了一个加载到果蝇幼虫生活的神经末梢葡聚糖偶联合成的Ca 2 +指标的技术。特别强调的是放置在协议的那些方面最关键该技术的成功,例如如何以避免沿的隔离神经静电,保持编制的健康在扩展装载期间,,并确保轴突生存提供的Ca 2 +促进密封切断轴突末梢。低亲和力右旋糖酐标记的Ca 2 +的指标,如氟- 4和rhod,这显示了一个高信号的信噪比,同时微创干扰突触前的Ca 2 +动力学。葡聚糖共轭有助于防止钙进入细胞器如线粒体扣押+指标。加载技术可以同样适用于幼虫,胚胎和成人。
Protocol
- 选择一个干净的清扫菜,没有接触过任何固定液。
- 解剖流浪3 路龄果蝇在施耐德的果蝇含有钙的中等幼虫+和L -谷氨酰胺,(不削减任何神经或损伤肌纤维第7,6,13或12) 。
- 选择一个12微米的小费(内径)的玻璃灌装吸管。
- 使用注射器和油管(应用负压吸管)确保不妨碍枪头。
- 选择一个优良的塑料填充丝可插入玻璃吸管的长度。
- +指标绘制到5毫米右旋糖酐标记的钙 2〜1厘米的塑料丝。
- 切段所有的神经。
- 支持吸管上一个坡道,让枪头方法解剖幼虫的腹侧中线。
- 画出一个神经段第四砍完,不捏的神经,进入移液器(包括施耐德的培养基中的少量)。
- 取出油管,插入吸管的塑料丝,直到结束的灯丝在50微米的神经切断(避免触及神经)。
- 弹出足够的Ca 2 +到结束施耐德的中期量增加约33%(终浓度应小于2MM)神经指标。重要的 - 这必须在5分钟切割神经内完成。
- 在室温下放置在黑暗的准备,而神经负载。
- 40分钟后取出的Ca 2 +使用灯丝的指标。
- 离开地方吸管和填写完全新鲜施耐德的中期的,因为这将被用于刺激的神经脉冲。
- 允许的Ca 2 +指标在神经平衡至少60分钟,但不超过4小时,才开始的Ca 2 +成像。
- 冲洗新鲜施耐德的中期每30分钟一班,而它是平衡的准备。
- 20分钟前成像取代施耐德与淋巴,像第六溶液(HL6; MacLeod等人2002年,2003年)的中期。
- L -谷氨酸或谷氨酸可以添加到HL6在7MM的解决方案,脱敏突触后的谷氨酸受体,以防止神经诱发的肌肉收缩(MacLeod等人2004年。赖夫等人2002年,2005年)。
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
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