Summary
البروتوكولات وصف الخطوات الضرورية للحصول على بلورات حيود نوعية من البروتين غشاء بدءا من إعادة تشكيل البروتين في مرحلة مكعب lipidic (LCP) ، وإيجاد الظروف الأولية مع فحوصات ما قبل تبلور LCP - FRAP ، وإقامة محاكمات تبلور LCP الحصاد والبلورات .
Abstract
بروتينات غشاء أداء المهام الحرجة في الخلايا الحية المتصلة إشارة تنبيغ والنقل وتحولات الطاقة ، وعلى هذا النحو ، وتورط في العديد من الأعطال والأمراض. ومع ذلك ، فهم الهيكلية والوظيفية للبروتينات غشاء متخلفة بقوة وراء ذلك من شركائها القابلة للذوبان ، أساسا ، بسبب الصعوبات المرتبطة solubilization وجيل من بلورات نوعية الحيود. تبلور في mesophases lipidic (المعروف أيضا باسم الوسيط في بلورة أو LCP) هي تقنية واعدة والتي تم تطبيقها بنجاح للحصول على دقة عالية من البنى rhodopsins الميكروبية ، والبروتينات الضوئي ، الغشاء الخارجي برميل بيتا ومستقبلات البروتين يقترن G. الوسيط في بلورة يستفيد من البيئة الأصلية مثل غشاء وتنتج عادة بلورات مع محتوى أقل من المذيبات وترتيب أفضل بالمقارنة مع بلورة الحلول التقليدية من المنظفات. الطريقة ليست صعبة ، ولكن يتطلب فهم السلوك المرحلة الدهون والممارسة في التعامل مع مواد لزجة mesophase. هنا علينا أن نظهر وسيلة بسيطة وفعالة لجعل نظام الإجراءات الجزائية ، وإعادة تشكيل بروتين في الغشاء الدهني للطبقة ثنائية LCP باستخدام خلاط حقنة ، تليها الاستغناء عن أجزاء من نانولتر LCP إلى مقايسة أو لوحة التبلور ، وإجراء فحوصات ما قبل تبلور والحصاد من بلورات نظام الإجراءات الجزائية المصفوفة. هذه البروتوكولات تقدم دليلا الأساسية للاقتراب من المستوى المتوسط في تجارب التبلور ، ولكن كما هو الحال مع أي تجربة التبلور ، وفحص واسعة والتحسين المطلوبة ، وليس مضمونا بالضرورة إلى نتيجة ناجحة.
Protocol
ويظهر مخطط نموذجي لفي بلورة التجربة في المتوسط 1،2 Fig.1. قبل بلورة LCP - FRAP المقايسات اختيارية ، إلا أنها يمكن أن يسرع بشكل كبير من عملية البحث عن بلورة شروط الأولية ، وخاصة في حالة صعبة للبروتينات غشاء 3.
1. إعادة تشكيل البروتين في LCP
- تنقية البروتين غشاء مصلحة في التوصل إلى حل المنظفات وتركيز مجمعات البروتين / المنظفات ل~ 10 -- 20 ملغ / مل ، مع الحرص على عدم المبالغة في التركيز على 1،4 المنظفات.
- ~ نقل 25 ميلي غرام من الدهون LCP المضيفة (عادة monoolein) أو خليط الدهن إلى أنبوب من البلاستيك 1.5 مل واحتضانها في 40 درجة مئوية لعدة دقائق حتى تذوب الدهون.
- إرفاق مقرنة حقنة لحقنة 100 ميكرولتر الغاز محكم.
- تحميل المحاقن مع الدهن المنصهر باستخدام ماصة حجم قابل للتعديل. سجل حجم الدهون في حقنة.
- تحميل آخر حقنة 100 ميكرولتر مع الحل القائم على البروتين بنسبة الحل إلى البروتين الدهني 03/02 ت / V.
- الاتصال سواء عن طريق الحقن معا مقرنة المحاقن.
- دفع الغطاسون حقنة بالتناوب لتحريك الدهون والبروتينات من خلال إبرة الداخلية للمقرنة ، ذهابا وإيابا ، حتى تصبح متجانسة mesophase الدهون. LCP الأشكال تلقائيا عند الخلط الميكانيكي ، ويصبح البروتين في تشكيل طبقة ثنائية الدهن من نظام الإجراءات الجزائية. ويمكن التحقق منها عن طريق تكوين LCP اتساقه وشفافة مثل الهلام ، وبسبب غياب birefringency عند عرضها تحت المجهر مجهزة عبر المستقطبات ، أو ، إذا كان ذلك ممكنا ، وذلك باستخدام الصغيرة زاوية حيود الأشعة السينية 1.
2. LCP - FRAP فحوصات ما قبل تبلور
صممت LCP - FRAP المقايسات لقياس الخصائص نشر بروتينات غشاء تشكيلها في LCP في مجموعة متنوعة من الظروف الفرز 3. نشر طويلة المدى للبروتينات غشاء في LCP ضروري لبلورة ناجحة ، إلا أن المجهرية من LCP تقيد نشر أو مجاميع كبيرة من البروتينات البروتين oligomeric. وثمة سبب شائع للفشل في تجربة لبلورة المتوسط هو تجميع البروتين سريع مما يؤدي إلى فقدان نشرها. وقد تبين أن سلوك التجميع من البروتين يعتمد على بناء بروتين معين ، والدهون وتكوين المضيف من الحل الفرز 3.
- تسمية البروتين مع صبغة الفلورسنت (Cy3 أو ما شابه) في نسبة البروتين / صبغ ~ 100 / 1 ، إزالة الصبغة المتفاعل وتركيز البروتين ل~ 1 ملغ / مل. تسمية الأمينات إما مجانا أو thiols الحرة. عندما وضع العلامات الأمينات الحر ، استخدم الرقم الهيدروجيني بين 7 و 7.5 لتسمية يغلب الحرة N - محطة. أن تدرك أن وضع العلامات الأمينية يمكن أيضا تسمية الدهون المشترك مع البروتين النقي 2،3.
- إعادة تشكيل البروتين المسمى في LCP كما هو موضح في القسم 1).
- إعداد لوحات الفحص كما هو موضح في القسم 3) باستخدام حلول الفرز LCP - FRAP بدلا من الشاشات تبلور 2.
- احتضان لوحات عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة 12 ساعة على الأقل لتحقيق حالة التوازن.
- مكان واحد من لوحات على محطة LCP - FRAP والتركيز على أول بئر باستخدام الهدف 10X.
- 5 الحصول على صور الفلورسنت لالتقاط الأولية قبل المبيضة الدولة.
- تحريك الليزر. ينبغي تعديل قوة الليزر وعدد من البقول لتبييض ~ 30 -- 70 ٪ من البروتين المسمى في وسط البقعة المبيضة.
- مباشرة بعد التسبب في الليزر ، وبدء تسجيل سريع بعد سلسلة من الصور تبيض 200 ~ بمعدل أسرع وقت ممكن.
- اتبع مع تسجيل تسلسل بعد التبييض بطيئة من الصور ~ 50 ، واختيار الصور والتأخير بين 10-20 ثانية ، اعتمادا على معدل الانتشار من البروتين.
- إدماج كثافة داخل بقعة التبييض في جميع الأطر وتصحيحها للتبييض وشدة ضوء التقلبات خلال اقتناء بقسمة كثافة داخل بقعة المبيضة التي بلغ متوسط كثافة بقعة مرجعية من خارج المنطقة ليزر ابيض.
- تطبيع كثافة تصحيح لجعل كثافة قبل المبيضة يساوي 1 وكثافة الأولي ابيض يساوي 0.
- تناسب منحنى كثافة مقابل تطبيع الوقت ، F (ر) ، وذلك باستخدام المعادلة التالية : 5
ف (ر) س = M إكسب (- 2T / ر) × (I 0 (2T / ر) + I 1 (2T / طن)) ، (Eq.1)
حيث M هو جزء من الجزيئات المتحركة نشرها ، تي هي المرة نشر مميزة ، t هو الوقت الحقيقي من كل إطار مسجل ، 0 أنا وأنا هي السابعة 1 0 و 1 ش أجل تعديل وظائف بسل. - حساب معامل الانتشار ، D ، على النحو التالي :
D = R / 2 4T ، (Eq.2)
حيث R هو نصف قطرها من بقعة المبيضة. - نقل رس البئر المقبل ، وكرر الخطوات من 2.5) -- 2.13).
- مقارنة الكسور المحمول ومعاملات الحصول على نشرها لظروف مختلفة الفرز. تصميم شاشات جديدة تبلور على أساس المكونات التي سهلت انتشار البروتين والشروط باستثناء التي لم يكن لوحظ انتشار البروتين. إذا لم البروتين المنتشر في أي من الشروط فرزهم ، والنظر في توسيع مساحة الفرز أو محاولة بناء البروتين الجديد.
3. إعداد المحاكمات البلورة LCP
- إعادة تشكيل البروتين في LCP كما هو موضح في القسم 1).
- نقل LCP البروتين لادن الى 10 حقنة الغاز محكم ميكرولتر تعلق على موزع حقنة المتكررة.
- نعلق إبرة قصيرة القابلة للإزالة (قياس 26 و 10 ملم طول) لحقنة في 10 ميكرولتر.
- الاستغناء عن 200 من نظام الإجراءات الجزائية boluses NL على سطح أربع آبار مجاورة تشكيل مربع 2X2.
- تراكب كل من boluses LCP مع 1 ميكرولتر من المقابلة بلورة حل الشاشة.
- تتويج أربع آبار تحميل مع ساترة 18 مم مربع من الزجاج. تطبيق ضغط لطيف على ساترة لاغلاق الآبار.
- كرر الخطوات من 3.4) -3.6) مع مجموعة من 4 آبار المقبل حتى يتم شغلها لوحة كاملة.
- احتضان لوحة في درجة حرارة ثابتة ، والتحقق بصفة دورية لتشكيل الكريستال والنمو.
4. حصاد بلورات من LCP
- وضع لوحة مع البلورات البروتينية تحت المجهر ستيريو مع تقريب متغير ، مجهزة المستقطب الخطي الدورية ومحلل.
- كذلك التركيز على الاهتمام باستخدام الطاقة المنخفضة التكبير بحيث يتم وضع البئر كله داخل مجال الرؤية.
- يسجل الزجاج ساترة في أربع ضربات صنع مربع داخل حدود جيدا باستخدام زاوية حادة لقطع الحجر الشعرية السيراميك.
- الصحافة حول محيط احرز مع ملاقط حاد نقطة قوية لنشر الخدوش من خلال سماكة الزجاج ساترة.
- لكمة اثنين من الثقوب الصغيرة في زوايا عكس مربع وسجل.
- حقن ميكرولتر قليل من حل مرسب من خلال واحدة من الثقوب للحد من الجفاف خلال الخطوات اللاحقة.
- باستخدام إبرة حادة الزاوية التحقيق كسر الزجاج على طول واحد أو وجهين لتحرير مربع خفض التدريجي.
- رفع بعناية لمشاهدة مربع من الزجاج لبلعة المرحلة مكعب. إذا عالق البلعة إلى ساترة ، والوجه ثم مربع من الزجاج وأكثر من مكان في قاع البئر.
- إضافة ميكرولتر اضافية قليلة من حل مرسب ، على أن تستكمل مع البرد حاصن ، إذا لزم الأمر ، على رأس مكعب بلعة المرحلة التي تتعرض لها من البئر.
- زيادة التكبير للمجهر والتركيز على وضوح الشمس.
- ضبط الزاوية بين المستقطب ومحلل لزيادة التباين بين الكريستال مزدوج الانكسارية والخلفية ، مع الحفاظ على ما يكفي من الضوء لرؤية حلقة الحصاد.
- حدد MicroMount MiTeGen بقطر مطابقة حجم الكريستال والبلور ثم الحصاد مباشرة من نظام الإجراءات الجزائية التي تجريف عليه في MicroMount.
- فلاش تجميد MicroMount مع الكريستال المقطوع في النيتروجين السائل ، وشحنه إلى beamline مصدر السنكروتروني لجمع البيانات بالأشعة السينية 6.
5. ممثل النتائج :
وأعربت عن تصميمها الإنسان بيتا 2 الأدرينالية G مستقبلات البروتين يقترن (AR - 2 β T4L) في الفيروسة العصوية المصابة sf9 خلايا الحشرات وتنقيتها في dodecylmaltoside (DDM) / cholesteryl hemisuccinate (CHS) حل المنظفات منضمة إلى ناهض معكوس a جزئية carazolol 7. وكان المسمى البروتين مع استر NHS Cy3 واستخدامها في فحوصات ما قبل تبلور LCP - FRAP (الشكل 2). تنتج شاشات الشبكة الخشنة على أساس عدة شروط المحددة من نتائج LCP - FRAP المقايسات المبدئية الكريستال مثل يضرب (الشكل 3). أثمرت مزيد من التحسين ظروف مرسب بلورات نوعية حيود (الشكل 4).
الشكل 1. التدفق بيانيا من تجربة نموذجية LCP التبلور. لا وصف الخطوات في مربعات رمادية في البروتوكولات الحالية.
الشكل 2. LCP - FRAP مقايسة مع AR-T4L/carazolol 2 β LCP monoolein في مقرها. أ) من نتائج الفحص LCP - FRAP يؤديها في وضع الإنتاجية العالية التلقائي ، والتي هي عينة من المبيض كل لوحة 96 - جيدا بالتسلسل ويقاس مضان الانتعاش بعد حضانة و 30 دقيقة. يتم رسم الحصول على المبالغ المستردة مضان ، والتي تمثل جزء الهاتف النقال في كل عينة ، لجميع العينات 96. الحلول الفرز تحتوي على 0.1 درجة الحموضة M تريس 8 ، 30 ٪ V / V PEG 400 مجتمعة مع 48 أملاح مختلفة في اثنين من تركيزات مختلفة. B) ملامح الانتعاش الإسفار عن مندوب عدةresentative شروطه. منحنيات الخط الصلبة التي تمثل المعادل تناسبها. ويتم تحديد الكسور 1.The المحمول ونشرها باستخدام معاملات EQS. 1 و 2. انتعاش سريع من أقل من 10 ٪ في العينة التي تحتوي على كلوريد الصوديوم ومن المقرر أن الدهون fluorescently المسمى التعاون مع البروتين النقي.
الشكل 3. مشاهدات الكريستال الأولية AR-T4L/carazolol 2 β التي حصلت عليها لفحص الشبكة الخشن حول الشروط التي حددها الواعدة LCP - FRAP ، تحتوي على سلفات الصوديوم (لوحة أ) و نا فورمات (لوحة باء). يسمى البروتين مع استر NHS Cy3 وتؤخذ الصور الفلورسنت باستخدام الإثارة في 543 نانومتر ، والانبعاث في 605 نانومتر.
الشكل 4. بلورات الأمثل من AR-T4L/carazolol 2 β. تؤخذ الصور من بلورات نمت في وجود كبريتات الصوديوم (لوحات A و B) وK فورمات (لوحات C و D) في وضع brightfield (لوحات A و C) ، وعبر استخدام المستقطبات (لوحات وباء ودال).
Discussion
البروتوكولات توفير التوجيه البصري الأساسية للخطوات الرئيسية التي تشارك في أداء التجارب في التبلور المتوسط. أكثر تعمقا في التفاصيل المتعلقة بهذه البروتوكولات ، والتأكيد على المخاطر المحتملة ، وأوجه القصور أو طرق بديلة متاحة في أماكن أخرى 1،2. يمكن اختياريا LCP - FRAP المقايسات مساعدة في المراحل السابقة لتحديد بناء البروتين الواعدة ، LCP الدهون والمواد المضافة المضيف الدهون ، وكذلك الحد من نطاق ممكن ، والظروف precipitants العازلة 3. حالما يتم العثور على ضرب تبلور الأولية ، ينبغي أن يكون الأمثل من الحصول على بلورات ذات نوعية أفضل. التحسين من المستوى المتوسط في ظروف مشابهة تبلور أساسا إلى تحسين الظروف للبروتينات قابلة للذوبان مع إضافة المزيد من المعلمات المرتبطة تكوين LCP 1. بلورات البروتين غشاء تزرع في mesophase lipidic وعادة ما تكون أصغر في الحجم من الحصول على بلورات في محلول التنظيف ، ولكن أكثر أمر ، وبالتالي يستفيد بشدة من استخدام microfocus beamlines المتاحة في مصادر السنكروتروني الحديثة 6.
وقد تم العديد من الإجراءات ذات الصلة في بلورة المتوسط ، بما في ذلك إعداد مقايسة لوحات أو التبلور ، وإجراء فحوصات LCP - FRAP وكشف البلورات ، أو شبه آلي بالكامل 1،2،8،9 ، مما يسمح للفحص مجموعة كبيرة من الظروف بينما تستهلك كميات صغيرة من البروتين والدهون. من ناحية أخرى ، reconstitutions البروتين في LCP الكريستال والحصاد لا تزال العمليات اليدوية ومملة أكثر ، وبالتالي يكون هناك حاجة للتحسين.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل في أجزاء من المنح والمعاهد الوطنية للصحة GM073197 RR025336.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).
- Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).
- Misquitta, Y., Caffrey, M. Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J. 79, 394-405 (2003).
- Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys. J. 41, 95-97 (1983).
- Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam. J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization. J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys J. 81, 225-242 (2001).
