Summary
이 비디오에서는, 우리는 찬란 태그 PKCS을 사용하여 살아있는 세포에서 PKC translocation의 시각화를 보여줍니다.
Abstract
단백질 키나제 고사 (PKCS)는 같은 세포 성장과 학습과 메모리로 휴대 프로세스의 다양한 규제에 중심 역할을 트레오닌 kinases 세린입니다. 척추 동물에서 PKC isoforms 네 가지 알려진 가족이 있습니다 : 고전 PKCS (α, βI, βII 및 γ), 소설 형식 내가 PKCS (ε와 η), 소설 유형 II PKCS (δ와 θ) 및 비정형 PKCS (ζ 및 ι ). 고전 PKCS는 칼슘이 활성화하는 소설 PKCS는 가리비 활성화하지만, 칼슘 2 + - 독립하는 동안 +와 diacylclycerol (가리비). 비정형 PKCS는 +이나 가리비 칼슘이도에 의해 활성화됩니다. Aplysia californica에서는, 메모리 형성을 공부하기 위해 모델 시스템, 즉 세 신경계 특정 PKC isoforms 각 주요 클래스에서 하나 기존의 PKC APL I, 소설 종류 I PKC APL II 및 비정형 PKC APL III있다. PKCS는 지질 활성화 kinases되며 따라서 세포 신호에 대한 응답으로 고전과 소설 PKCS의 활성화가 자주 세포질에서 플라즈마 막에 PKC translocation와 상관되었습니다. 따라서, 라이브 세포에서 실시간으로 PKC translocation을 시각화하는 것은 PKC 활성화로 이어질 신호 전달 경로를 elucidating위한 소중한 도구가되고있다. 예를 들어,이 기술은 PKC의 다른 isoforms은 시냅스 소성의 독특한 유형을 중재하기 위해 서로 다른 조건에서 이동시키다 및 PKC APL II의 세로토닌 (5HT) 활성화가 가리비와 phosphatidic 산성 (PA) 모두의 생산을 필요로 설립 우리에게 허용되었습니다 translocation 1-2. 중요한 것은, 같은 신경을 시각화하는 능력은 반복해서 우리가 예를 들어, 정교한 세부 3 PKC 응답의 desensitization를 측정할 수있다. 이 비디오에서는, 우리는 Sf9 세포 문화를 준비하는 각 단계를 보여, Aplysia 감각 뉴런의 문화가에 대한 응답으로 Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런과 PKC translocation 라이브 영상에 찬란 태그 PKCS을 표현, 다른 영상 제 4에 설명되어있다 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 다른 activators.
Protocol
1. 준비 및 Sf9 세포 Monolayer 문화의 유지 보수
- Sf9 세포 배양 및 유지 관리는 조직 문화 후드에서 수행됩니다.
- Sf9 세포 Spodoptera frugiperda의 난소 세포 (Sf21 세포)에서 파생되며 Invitrogen에서 그레이스의 미디어에 냉동 세포로 구입할 수 있습니다.
- 보충 그레이스의 곤충 매체 (1X), 30 % 태아 소 혈청 (FBS) canted 목이 75cm 2 세포 배양 플라스크에 추가되었습니다. 장소 8 ML
- (1-2 분) 앞뒤로 튜브를 이동하여 37 ° C의 물을 욕조에 빠르게 Sf9 세포의 냉동 튜브를 녹여.
- 고르게 세포를 배포 손으로 부드럽게 75cm 2 세포 배양 플라스크와 암석 플레이트에 Sf9 세포를 전송합니다.
- 세포가 첨부 ° C가까지 27 1-2 시간 품어.
- 오래된 매체를 제거 30 % FBS와 freshGrace의 곤충 중간의 10 ML로 바꿉니다.
- 세포가 합류 아르 ° C까지 27 알을 품다.
- monolayer 문화를 유지하려면, Sf9 세포의 합류 술병에서 이전 미디어를 제거와 10 % FBS와 그레이스의 곤충 중간의 5 ML를 추가합니다.
- 가볍게 술병의 측면에 Sf9 세포를 분리하기 위해 여러 번 누릅니다.
- 피펫은 아래 pipetting 동안 플라스크 벽을 분사 한번 부드럽게, 위아래 10 ML 피펫과 pipettor을 미디어 사용합니다. 멸균 15 ML Polysterene 튜브에 세포를 전송합니다.
- 손으로 부드럽게 새로운 75cm 2 세포 배양 플라스크와 바위 플레이트에서 10 % FBS (로그 위상 성장을 유지하기 위해 1시 5분 희석)와 그레이스의 곤충 중간 8 ML에 Sf9 세포 현탁액 2 ML을 추가합니다.
- 세포가 합류 아르 ° C까지 27 알을 품다.
2. Sf9 세포에서 찬란 태그 PKCS 표현
- 에 대한 라이브 영상 실험, 문화 35mm MatTek 유리 바닥 문화 disheswith 14mm와 0.16-0.19 mm의 coverslip 두께의 유리 표면에 Sf9 세포.
- 형광 단백질 태그 PKCS는 아래에 설명된 수정 제조 업체의 Cellfectin II의 transfection 시약 다음과 같은 권장 사항을 사용 Sf9 세포에 표현됩니다.
- 1 일 : 전에 세포를 도금하기 위해 최소 30 분 10 % FBS와 그레이스의 곤충 중간 각 MatTek 요리를 취급.
- hemacytometer를 사용하여 11 단계 (위)에서 Sf9 세포를 계산합니다.
- 플레이트 0.05 150 μL의 총 볼륨의 각 MatTek 유리 coverslip에 X 10 6 세포. 세포가 실온에서 30 분 첨부할 수 있습니다.
- 그레이스는 세포를 분리하지 않도록 천천히 한 번에 하나씩 각 접시 하나 ML 10 % FBS와 보충의 2 ML을 추가합니다.
- ° C 하루 27 알을 품다.
- 이 시점부터, 플라스미드 DNA와 Sf9 세포의 transfection에 대한 제조 업체의 추천을 사용합니다.
- 일 2 : Cellfectin II의 transfection 시약을 사용하여 찬란 태그 PKCS와 Transfect Sf9 세포. 우리는 종종 향상된 그린 형광 단백질 (eGFP) 및 monomeric 레드 형광 단백질 (mRFP) (플라스미드 건설에 대한 세부 이전 2,5 설명했습니다)로 태그가이 시스템 PKCS 공동 표현했습니다. 한 번에 하나의 형광 단백질의 표현이 70-80 % 정도 세포를 표현 72시간 게시물 - transfection을 산출. 이 형광 단백질의 공동 표현은 약 30 % 공동 표현 세포에 transfection 효율을 감소시킵니다. eGFP - 태그 PKC 및 mRFP - 태그 PKC를 공동 표현하면, 최적의 단백질 표현 mRFP - 태그 단백질에 대한 더 플라스미드 DNA를 2 배 사용합니다.
- 수행 라이브 영상 48-72시간 포스트 transfection (최적 단백질 표현, 72 시간 기다).
3. Aplysia 감각 뉴런의 찬란 태그 PKCS 표현
- Aplysia의 연결을 세포 배양의 준비는 조 및 동료 4의 비디오 문서에 설명되어있다.
- 형광 단백질 태그 PKCS는 아래 자세한 microinjection 절차를 사용 Aplysia 감각 뉴런으로 표현됩니다.
- 증류수에 1퍼센트 빠른 그린 (FCF)의 주식 솔루션을 준비, 주사기와 주사기 28mm 필터 (0.20 μm의)을 사용하여 필터링합니다. -20 ° C.에서 나누어지는 및 저장
- 감각 뉴런의 Microinjection은 뉴런를 분리 후 1 일 또는 2 일에서 수행하지만 우리는 이일 기다리는 것은 coverslip 더 나은 휴대 준수에 대한 허용 찾을 수 있습니다.
- 일 2 감각 뉴런의 분리 후, 빠른 그린의 나누어지는를 해동하고 주사기와 주사기 28mm 필터 (0.20 μm의)를 사용하여 다시 그것을 필터링합니다.
- 0.5 % 빠른 그린을 포함하는 증류수에 플라스미드 DNA의 솔루션을 준비합니다. μg / μL 0.4처럼 높은 플라스미드 DNA의 농도는 사용할 수 있지만 이러한 값을 위의 이동하지 않는 것이 좋습니다.
- 1 ML의 주사기와 4mm 주사기 필터 (0.20 μm의)를 사용하여 플라스미드 DNA / 고속 그린 솔루션을 필터링합니다.
- 마이크를 사용하여 15 분 동안 16,110 XG에서 플라스미드 DNA / 고속 그린 솔루션을 원심 분리기rocentrifuge.
- microelectrode의 풀러를 사용하는 뉴런의 microinjection (서터 플라밍 / 브라운 Micropipette 풀러, 모델 P - 97)에 대한 날카로운 전극을 준비합니다. 상자 필라멘트를 사용하여 1mm 외경, 내부 직경 0.75 mm와 내부 필라멘트 (세계 정밀 계측기가 TW100F - 4)와 얇은 벽을 유리 모세관을 사용하여 100mm 길이로 유리 microelectrodes를 가져옵니다. microinjection 전극을 당기에 대한 자세한 내용은 서터 전극 요리책을 참조하십시오.
- microloader 피펫 팁 (eppendorf CA32950 - 050)를 사용하여 플라스미드 DNA / 빠른 그린 솔루션 2 μL와 각각의 전극을 입력합니다.
- microinjection 역에 Aplysia의 연결 문화를 포함하는 MatTek 유리 바닥 문화 요리를 전송합니다.
- microinjection 역은 다음으로 구성되어 있습니다 : 집에서 만든 진동 절연 테이블 (운동 시스템 진동 절연 워크 스테이션), 외부 할로겐 조명과 스테레오 - 범위, micromanipulator (서터 헉슬리 월 종류 Micromanipulator의 문화 요리를 잡아 큰 유리 단계 하는)는 세 개의 축에 굵고 울트라 좋은 위치 모두를 허용, 공압 펌프 (세계 정밀 계측기 PV820 공압 피코 - 펌프)에 연결된 microelectrode 홀더. 공압 펌프의 압력 입력은 압축된 질소 탱크에 연결됩니다.
- microelectrode 홀더에 microelectrode를 넣습니다.
- 스테레오 현미경으로 보는 세포의 핵에 micropipette의 끝부분을 삽입합니다.
- 질소 부족 압력 펄스 제공 (기간이 10-100 MS를, 20파운드 / 2) 핵은 녹색 uniformely 될 때까지.
- 실온에서 4 시간 동안 세포를 부화하고 ° C까지 사용 4 계속. 24시간 후 사출 - 최적 PKC translocation 들어, 라이브 영상 실험 20 수행합니다.
4. Sf9 세포를 생활과 Aplysia 감각 뉴런에서 PKC Translocation의 시각화
- 이미징을 위해, 우리는 Axiovert 200 자이스 혈구 LSM510 거꾸로 공촛점 현미경을 사용합니다.
- Aplysia 감각 뉴런은 x40 오일 침지 목적으로 몇 군데 반면 Sf9 세포 x63 기름 침지 목적으로 몇 군데 위치 : 영상 프로토콜은 다음을 제외하고 Sf9 세포와 Aplysia 감각 뉴런에 동일합니다. Aplysia 감각 뉴런이 18-20 O C. 주위 유지 실온에서 몇 군데 반면 Sf9 세포는 26-27 O C에서 유지 온도 제어 챔버에 몇 군데 아르
- 우리는 eGFP 단백질과 mRFP 단백질 태그 이미지 PKC에 HeNe 레이저 (543nm에서 여기)와 태그 이미지 PKC 50 %의 레이저 출력 30 MW 아르곤 레이저 (488nm에서 여진)을 사용합니다. 아르곤과 HeNe 레이저 라인 4 %로 감쇠하고 사전 이미징 및 핀홀을 각각 50 %의 전송 출력은 하나 조정됩니다.
- 이미징 무대에서 안정화 문화 요리를하고 운동이나 진동을 방지하는 것이 중요합니다.
- 부드럽게 접시 1 ML 전체 볼륨을 떠나는 10 ML의 피펫을 사용하여 요리의 문화 미디어 1 ML를 제거합니다.
- 핵을 볼 수있는 세포의 중간 부분에 사진을 가져가라.
- 사진 매 30 초 복용 10-20 공촛점 이미지의 시계열을 설정합니다.
- 시간 시리즈를 시작합니다.
- 이 그림은 (30 초 시점 이후) 촬영한 후, 부드럽게 약 1 ML (2X 농도) P1000 피펫을 사용하여 세포의 상단에 드롭하여 놓기를 추가합니다. 약물은 약 30 초 동안 지속적으로 추가됩니다.
- 일부 약물은 다른만이 최적의 5-10분 후 치료 (영화 1 영화 2)는 느린 translocation을 유도하는 동안 (60 초 시점에서) 바로 다음과 같은 약물 치료를 볼 수있는 빠른 translocation을 유도.
- 약이 씻겨해야하는 경우, 접시 한쪽에 하나 피펫과 함께 부드럽게 아래로 세척 버퍼를 pipetting과 반대편에있는 미디어를 pipeting, 세탁을 2 X 10 ML의 pipets를 사용합니다.
- 세척 효과되었으며 약물의 영향이 가능해 경우, PKC는 30-60초 이내 cytosol로 돌아갑니다.한다면
- LSM 파일로 동영상을 저장합니다.
- LSM 파일을 열고 이미지 전후 약물 치료 수치 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용합니다. 부량는 다른 하나 설명되었습니다.
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Discussion
우리는 Sf9 세포와 감각 뉴런 Aplysia에서 실시간으로 찬란 태그 PKCS의 이미지 translocation에 기술을 설명합니다. culturing 그들을 transfecting 아주 스트레이트 포워드이기 때문에 Sf9 세포 이미지 PKC translocation하는 간단한 시스템을 제공합니다. 대조적으로, Aplysia 감각 뉴런의 microinjection은 주인에게 몇 시간이 걸립니다, 최대 몇 개월까지. 이 기법에 관한 어려움 전극 막히는가 포함되어 있습니다. 사출 솔루션을 필터링하고 centrifuging하는 것은 일반적으로 도움이되지만 그것을 작성하는 동안 때로는 공기 방울은 전극이 형성될 수 있기 때문이다. 우리는 대신 모세관 현상의 전극을 채우기 위해 microloader 피펫 팁을 사용하면 기포 형성을 최소화하는 데 도움이 것을 발견했습니다. 라이브 영상에 관해서는, 두 가지 요인은 단단히 영상 세션 동안 제어해야 : 온도 및 움직임. 온도 변동이 translocation에 영향을 줄 수 및 온도 제어 챔버의 사용을 고려하여야한다. 이미징하는 동안 움직임을 방지하기 위해 진동 절연 테이블 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 웨인 S. Sossin으로 보건 연구 (CIHR) 부여 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 캐롤 A. 파라이 드 라 퐁 물리 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ)와 콘라드 해링턴 교제에서 박사 후 교제의 수상자이다. 저자는 그래픽 개요 도움 비디오 촬영과 매들린 리치몬드 풀에 대한 도움 조애너 부기, 마가렛 헤이스팅스와 마가렛 Labban 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Use to make micr–lectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Micr–lectrode holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Use to hold micr–lectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Use to position micr–lectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
