マウスにおける冠動脈閉塞のために掛かる重量のシステムの使用

Summary

心筋虚血や虚血プレコンディショニングのためのマウスモデルでは、重要なツールの研究心保護メカニズムです。

Abstract

異なる遺伝子のノックアウトマウスは^{1から38まで} 、ますます利用可能になってきているように急性傷害のマウスの研究では、強烈な研究領域です。虚血プレ​​コンディショニング（IP）による心臓保護には強烈な調査の領域である。さらに、その分子基盤を解明するために、ノックアウトマウスの研究での使用は^{、、、39 30 14 7}は特に重要です。以前の研究では、既に正常マウスでは心筋虚血と再灌流を実行したという事実にもかかわらず、このモデルは、技術的に非常に困難です。特に、サポートされている結び目で容器をオフに接続することにより、冠状動脈、血管の周り縫合糸の配置と冠動脈閉塞の視覚的な識別は、技術的に困難である。さらに、外科手術による外傷を引き起こすことなくIPの間に冠状動脈の断続的な再灌流のために再オープンする結び目は追加の課題が追加されます。結び目が縛られていない場合はさらに、冠動脈の不完全閉塞に起因する強いほど、不注意な再灌流が結果に影響を与える可能性があります。実際に、これは簡単に拍動する心臓の動きが原因で発生する可能性があります。

結び目冠動脈閉塞のシステムを使用して関連付けられている潜在的な問題に基づいて、我々は、IP ³⁹の間に断続的に冠状動脈閉塞のために掛かる重量のシステムに基づいて、慢性心筋症の以前に発行されたモデルを採用した。実際には、冠状動脈の閉塞は、このように結び目で冠動脈を閉塞することなく達成することができます。また、血管の再灌流を容易に心臓の組織からのリモートローカライズになってぶら下がって重みをサポートすることによって達成することができます。

我々は、虚血と再灌流時間、プレコンディショニング連隊、体温と遺伝的背景³⁹の変動を含め、体系的にこのシステムをテストした。染色を梗塞に加えて、我々はこのモデルで心筋梗塞のマーカーとしての心臓トロポニンI（cTnI）をテスト。実際には、cTnIの血漿レベルは、梗塞サイズ（R2 = 0.8）と相関。最後に、我々はこの手法は、マウスIPと心筋梗塞^{6、8、30、40、41}の間に高い再現性梗塞の大きさをもたらすことがいくつかの研究で示すことができた。したがって、この手法は、標的遺伝子の欠失を持つマウスの遺伝学的アプローチを使用してIPによる心臓保護に関与する分子機構を追求する研究者にとって役に立つ場合があります。トランスジェニックマウスを用いた心臓のIPに関するさらなる研究は、この手法を検討することがあります。

Protocol

総論：

すべての操作は、直立解剖顕微鏡（オリンパス、STU2 StandBoomスタンドとZ軸のクランクポストとのSZX10）の下で行われ、外科的凝固剤を使用する必要があります。換気は、手続きのための重要であるため、ある程度の時間は、人工呼吸器を選択すると換気技術の最適化に使われるべき。温度、血圧、麻酔は終始安定している必要があります。

1。麻酔、挿管およびモニタリング

1. 少なくとも10週齢C57BL / 6マウスを使用してください。投与量は70mg / kg体重のIPでのペントバルビタールナトリウムを使用して誘導する麻酔は約10 mg / kgの/ hのペントバルビタールナトリウムで麻酔を維持してください。これは著しく血圧を下げる可能性がありますので過剰摂取に注意する。ペントバルビタールの再投与 - であっても後の血漿中レベルの深刻な増加につながる時間は、できます。心保護化合物としてイソフルランに関する強力な証拠に基づいて、我々は"不活性"とも心筋虚血^{46から56まで}のモデルにペントバルビタール確立の使用をお勧めします。
2. 37℃で体温を維持するためにサーマルフィードバックコントローラに接続されている直腸温度計のプローブを用いた温度制御加熱テーブル（RT、Effenberg、ミュンヘン、ドイツ）℃の上に置いてマウス
3. 麻酔導入後の仰臥位でのセキュアなマウス、テープと足首に固定縫合糸を使用してテーブルに取り付けられた上下肢を持つ。歯を使って、ヘッドも同じことを行います。十分な差し止めが成功挿管とよく管理された手術のために重要です。手術前に、マウスの毛のアレルギーのリスクを減らすためにミネラルオイルを使用してマウスをカバー。
4. 外科的気管を公開し、bluntpolyethyleneカニューレ（Insyte 22グラム、ベックトンディッキンソン、米国）を用いて気管挿管を行います。あなたは、スタイレットとしてそれを使用できるように針を平滑する必要があります。
5. ピンセットを用いて舌を引き抜いてから、体に向かって15度の角度で軽く押してください。であっても気管の曝露後、顕微鏡を使用して、これはいくつかの訓練が必要になる場合があります。気管の小さな損傷は縫合糸を通して動物を換気することができないにつながる可能性があることに注意してください。もし発生した場合はこのように、気道の問題は、小さな穴のための気管を確認してください。
6. カリーナ上記以前に公開された気管内カニューレの直接可視化することにより正しいチューブの位置を確認してください。
7. 人工呼吸器にチューブを接続します。我々は、 シーメンス （DRE獣医、米国）からサ ​​ーボ、900℃を使用することにより、圧力制御換気のテクニックをお勧めします。動物を10ミリバール、110回/分とFIO ₂を3から5ミリバールの呼気終末陽圧= 0.4の周波数の最大吸気圧を用いて換気されます。設定は、開いている胸部の手術時に肺をチェックすることによって最も容易に達成できるいくつかの調整が必要になる場合があります。肺が倒壊またはすぎたでないことを確認してください。サーボ900℃が人間のための人工呼吸器として構築されているという事実にもかかわらず、圧力制御された人工呼吸器の設定での使用は、マウスの換気のために優秀作品。
8. I - STATを使用して換気の時間の4〜6時間後に通常のガス交換（酸素の分圧、115のパオ₂ ± 15 mmHgと二酸化炭素、38のPaco _2の分圧± 6 mmHgに）確認するために血液ガス分析を実行システム（アボット、米国）。
9. ECG（例えばヒューレットパッカード、ベーブリンゲン、ドイツ）と心拍数を監視します。心拍数が450以下に低下しないことを確認してください。マウスが発症した場合bradicardiaは、温度と麻酔用量/濃度を確認してください。 Xylacin /ケタミン麻酔は250 /分の心臓の心を誘導し、したがって、推奨されません。
10. 適切な水分補給を適用します。動脈または静脈カテーテルを介して通常の生理食塩水は0.1ml /時間で注入する前虚血の発症に行う必要があります。また、500μlの生理食塩水ボーラスは、術前にIP提供されていました。 Thoractomyは、血圧の低下を引き起こすことができるし、追加の生理食塩水薄利が必要な場合があります。虚血後、最大1ミリリットル/時間の注入速度は60 mmHgの上記の平均動脈血圧を維持し、TTCを用いて梗塞染色のための重要な十分な再灌流を保証するために必要になる場合があります。
11. 血圧の連続的な記録のための頸動脈を（PE10、チップ外径（mm /"）、テーパー> 0.024 mm/.011"）に置きます。頸動脈は、気管の筋肉の鈍的切開を介して公開されます。さらなる暴露とあらゆる組織の外傷（迷走神経の特定）を慎重に回避に続いて、カテーテルは、2つの縫合糸と小さなクランプを使用して血管に挿入されます。あなたが動脈の解剖を開始する前に本体にアームを取り付けます。これは動脈の長い部分を公開します。頸動脈の近位部の結び目は非常に終わり。に縫合糸の端に大きなクランプを取り付けますテンションを得る。動脈の周囲に別の縫合糸を配置し、非常に先端部に動脈を細かく分析。ここでは、小さなクランプを配置。動脈に小さな斜めの開口部をカットするマイクロはさみを使用してください。微細な鉗子（デュモン、WPI）に開口部をホールドし、あなたの手/鉗子で適切なサイズのカテーテルを進める。 2番目の縫合糸で結び目を作り、動脈を確保する。クランプを緩め、さらにカテーテルを進める。いくつかの結び目とテープでカテーテルを固定します。

2。冠動脈閉塞のテクニック

1. 皮膚を摘出し、鈍的切開法を用いて、左胸部の壁を公開。
2. 焼灼と胸部の壁を露出させる筋肉の胸の専攻と未成年者をカット。大胸筋を引いて、肺は、それによって電気手術器から鉗子は、肺上記1〜3ミリメートル、リッピングが凝固する必要がある交差水平線を挿入し、することができる、ドロップします。
3. 平滑はさみを使用して、胸部の壁をカット。キャッチプレートを取り外すと、鈍端が曲がっている修正された安全性のピンは、、その後、胸部を開いたままにするために使用されます。
4. 縫合糸の最終的な配置を容易にするために、凝集および胸部の左下側に向かって振動板に沿って胸部の壁をカット。
5. 心膜を切開によって心臓を公開。横隔膜の動きを回避するには削除し、横隔神経を切断。
6. ピンセットで小さなウェットコットンスティックを使用し、右側に向かって心を回します。左冠動脈（LCA）を特定し、肺があまりにも水増しされていないことを確認してください。縫合糸を配置する際に、心臓の安全なホールドを持っている胸部の開口部を最適化する。血圧が低すぎる場合は識別が複雑になることがあります。生理食塩水の追加玻璃LCAの識別が向上することがあります。 LCAは、（返す静脈とは対照的に）水平に中心を横切る明るい赤色の容器です。時々、LCAは、顕微鏡なしで最高の見られている。あまりにも多くの光を使用しないでください。これは、可視化が不可能になる反射を切断する可能性があります。
7. LCAが視覚的に識別されると、LCAの周りに8.0ナイロン縫合糸（Prolene、エチコン、Notiefies、米国）を置きます。断続的なLCAオクルージョンの目的のために、我々は掛かる重量のシステムを使用して心筋症⁴²の慢性的なモデルを採用した。
8. スレッド縫合鈍端のプラスチックチューブの小片（PE - 10チューブ）を介して、それぞれの端に二つの小さな重みを（1グラム、例えば水で満たされたエッペンドルフチュー​​ブを使用）を添付。自由にロッドを介して吊り下げ重みで、LCAは、すぐに閉塞してください。さらに、重みが緩和されると、LCA閉塞が一度に終了されます。成功したLCA閉塞は明るい赤から濃い紫に容器、容器（明るい赤から白へ）と心電図におけるST -標高の存在によって提供される心筋の色の変化の直接の色の変化によって確認されるべきである。再灌流時には、色の変化が瞬時に消えます。 37 ° C、脱脂綿の生理食塩水に浸した、作品を通して（図1も参照）との心は濡れてください。
9. あなたの主な関心を応じて虚血の時間を選んだ。実際には、IPの心保護効果の研究のために、それはAARの約30〜40％の梗塞サイズの関連付けられている虚血時間を使用することが理想的です。従って、それは心臓のIPまたは実験的治療または特定の遺伝子の欠失を持つ大規模な梗塞サイズの小さい梗塞サイズを例えば、両方向の変化を実証することが可能になります。 60〜80パーセントの梗塞サイズはしばしば生存と再灌流時間が完了する前に動物が死んでされていないのに対し、さらに、50％未満の梗塞サイズを持つマウスには、通常、実験後も存続する。 3.5の梗塞サイズにおける再灌流の結果の2時間± AARの1.3％が続く心筋虚血の我々のモデル10分を使う。 42の平均梗塞サイズで60分の結果を対照的に、虚血時間± AARの5.2％（P ^{<0.01）39。}従って、我々は両方の方向の変化を研究する理想として虚血の60分を考慮してください。それにもかかわらず、この断絶の表現型と遺伝子標的マウスでは虚血時間を調整する必要があります。
10. 右再灌流時間を選んだ。再灌流時間は、TTC染色のために非常に重要です。無色の染料は、補酵素NADHの​​存在下で脱水素酵素によって赤れんが色の色の沈殿物に還元される。死細胞はNADHと、それゆえ、赤ステンド生存心筋内淡い分野として線引きされているを保持する能力を失う。 TTCによる梗塞サイズの描写はそのNADHが壊死領域から完全に洗い流されている必要があります。再灌流の長さが足りない場合は、TTC染色により梗塞サイズの線引きは、実際の梗塞サイズ⁴³の過小評価になることがあります。私たちの手で、60分の虚血時間の後、梗塞サイズの測定は11.5から増加± 42.2から30分後に4.5％± 5.1％120分後。梗塞サイズのそれ以上の増加は、より長い再灌流時間（240分^）39で検出されなかった。従って、我々はあなたが虚血が予備検討心臓酵素determination.Ifのコンテキストでも合理的と思われる2時間の再灌流の期間をお勧めします、我々は60の虚血時間が続いて、IPの4サイクル（5分虚血5分の再灌流）をお勧めします分及び2時間の再灌流時。これらの条件下で、IPは42.2から梗塞サイズの3.2倍の減少± 5.1％13.3 ± AAR ³⁹の3.3％と関連していた。しかし、掛かる重量のシステムのために、異なる前処理連隊は、簡単に適用することができる。

3。リスク領域の決定（AAR）と心筋梗塞サイズ

心筋梗塞（IPの有無にかかわらず）の誘導後、エリアをLCA（リスク領域、AAR）によって灌流されており、梗塞自体のサイズは、染色の技法を用いて決定されます。続いて、梗塞は、AARと比べて心筋梗塞の割合として計算されます。これを行うには、エバンスブルー及びトリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）と前述の二重染色の技法は^、44を使用されています。

1. LCAがオクルードされている間大動脈に1パーセントエバンスブルー色素の逆行性注入により、AARを決定します。また、総頸動のカテーテルが所定の位置にある場合は、エバンスブルーの注入のためにこのルートを使う。エバンスブルーはAARを除いて、すべての心筋組織の青色の染色になります。それらが冠循環に注入し、エバンスブルー染色を防止されるように、それは、カテーテル内に気泡を避けるために、このステップが重要です。前のエバンスブルー染色することは、心臓の酵素測定用の血液を収集する場合があります。さらに、大動脈や総頸動カテーテルを介して生理食塩水5mlを注入することにより、血液の除去をお勧めします。
2. 生理食塩水氷冷0.9％の消費税中心と洗浄
3. 2％アガロースに埋め込みます。これが成功染色を防止するので、ホットアガロースを使用しないでください。
4. +4℃（または15分-20℃）で30分後に、心​​臓の行列やミクロトームを用いて1 mmのスライスに心をカット。あなたが冷凍庫に心を置くときは、非染色した心臓につながる乾燥凍結を避けてください。
5. 37で1％TTCでスライスをインキュベート℃の水浴で15ミリリットルの青いキャップを使用して10分間。これは、梗塞部位が赤色生存組織の汚れている間、白い領域として画定できるようになります。
6. 一晩10％fomaldehydeで染色したスライスを凝視する。そうすることによって、梗塞領域がより良い写真の質の向上対比される。
7. リスク領域（AAR）とNIHソフトウェアイメージ1.0 ^45を使用して面積測定を介して梗塞サイズを決定します。
8. リスクのあるエリアから、梗塞心筋のパーセントを計算する。

4。心臓酵素の測定

TTC染色に関連付けられている制限のために我々は、心筋梗塞の重症心筋トロポニンI（cTnI）マウスの血清中のレベルの決定のためなど、追加の読み出しをお勧めします。血液は、門脈から取得され、血清cTnI濃度は、定量的な急激なcTnIアッセイ（生活の診断、（株）、ウエストチェスター、ペンシルバニア州、米国）で決定される。

5。代表的な結果：

図1。冠動脈閉塞のハンギング重量のシステムを使用して心臓のIPの（）モデル。この手法は、冠動脈閉塞のための結び目を必要としません。 （B、C）外科セットアップ。閉塞後の左冠動脈（LCA、矢印）とマウス心臓の（D）イメージ。 LCAの視覚的な識別は、ライゲーションおよびマウスにおける虚血プレコンディショニングのために必要です。 8.0ナイロン縫合糸は、左心耳の下LCA 1-2 mm程度に配置されます。縫合糸は、小さなプラスチック製のチューブ（*）を介してスレッド化されています。各縫合糸の端は小さな重量（1G）に添付されており、縫合糸を両側の棒の上に配置される。 LCA閉塞や大動脈へのエバンスブルー色素の逆行性注入後のAARの（E）決定。 AARは、心筋の残りの部分が青のときに未染色のまま。生存組織染色された赤一方、TTC、白梗塞部位のステンドグラスとAARの組織のインキュベーション後。

Discussion

本研究では、ハンギングウェイトシステムを使用して無傷のマウスモデルでIPを実行するため、結び目によって冠状動脈の閉塞を回避する斬新な手法を説明します。実際には、本研究はこのように結び目ベースの冠動脈閉塞モデルに関連付けられたばらつきを最小限に抑え、IPによる高い再現性梗塞サイズと心筋保護を示しています。マウスでのIPによる心臓保護を研究検討する研究者らは、このモデルの恩恵を受ける可能性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4mg/mL in saline
TTC	Sigma-Aldrich	17779 Fluka	1.5 % in PBS
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	10g in 1 L PBS
Insyte 22 G	BD Biosciences	n/a
Suture, silk 4.0	Harvard Apparatus	517698
Suture, Prolene 8.0	Ethicon Inc.	M8739	reusable
Heart Matrix	Zivic Instruments	# HSMS001
Siemens 900 C	DRE Veterinary	# 336	refurbished
dissecting microscope (SZX10 )	Olympus Corporation	n/a	consider generous working distance
Heating Table	Rt, Effenberger, Germany	n/a	only and single provider
Blood pressure device	Cyber Sense, Inc	BPM02
I STAT	Abbott Laboratories	n/a