הכנה והתרבות של שמיעתית פרוסות עוף גזע המוח

Summary

גזע המוח השמיעתית עוף מורכבת גרעינים אחראי לעיבוד צליל binaural. הכנה אחד פרוסה העטרה שומרת את כל המעגלים, בעוד גישה תרבותית מספק הכנה מיוחדת כדי לחקור את התפתחות מבנה ותפקוד עצבי השמיעה ברמה המולקולרית, התאית הרשת.

Abstract

גזע המוח השמיעתית עוף היא מערכת מבוססת מודל, שבו נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד את האנטומיה והפיזיולוגיה של עיבוד שמיעתי בתקופות דיסקרטי הפיתוח ^1-4, כמו גם מנגנוני קידוד הזמני במערכת העצבים המרכזית ^5-7.

כאן אנו מציגים שיטה להכין עוף גזע המוח השמיעתית פרוסות כי ניתן להשתמש הפרוצדורות חריפה או פרוסות תרבות organotypic לטווח ארוך מניפולציות ניסיוני.

גזע המוח השמיעתית עוף מורכב angularis גרעין, זית magnocellularis, laminaris מעולה. גרעינים אלה אחראי לעיבוד צליל binaural חד ההכנות פרוסה העטרה לשמר את המעגלים כולו. בסופו של דבר, תרבויות פרוסה organotypic יכול לספק את ההזדמנות כדי לתפעל מספר פרמטרים התפתחותיים כגון הפעילות הסינפטית, ביטוי של מרכיבים טרום postsynaptic, ביטוי של רגישות להיבטים השליטה גן ביטוי ההפרש

גישה זו יכולה לשמש כדי להרחיב את הידע הכללי על התפתחות המעגל העצבי עידון, והתבגרות.

Protocol

1. הכנת שטח הביתור

1. ברציפות נוזל השדרה בועה מלאכותית מוחין (ACSF) בתערובת של 95% O ₂ / 5% CO ₂ (pH שבין 7.2-7.4, osmolarity 295-310 mOsm / ליטר).
2. בעוד ACSF מבעבעת, נקי עבודה עם שטח EtOH 70%. כמו כן לנקות את vibratome ואת להב חיתוך. יש לשטוף את הסכין עם מים מזוקקים (DH ₂ O).
3. המקום נקי כרית ספיגת נוזלים על ביתור שטח עם כלים לנתח המתאים.
4. דבק לחסום אגר (40 מ"ג agarose / mL, 4%, כלומר ב DH ₂ O) לשלב של החדר vibratome-חיתוך *.
   * טיפ: להכין אגר לפני לנתיחה. חנות מוכנות אגר בתוך צלחת פטרי מכוסה במקרר. Agarose שנרכשו EMD כימיקלים או Invitrogen.

2. הכנת 6-גם צלחות עם בינוני תרבות

1. מתחת למכסה המנוע סטרילית, למלא היטב 1 לכל חיה של צלחת 6-היטב עם 1 מ"ל של מדיום תרבות לדגור על 35 ° C ו 5% CO _2.
2. הכינו כמה שיותר קרום מוסיף תרבות הצורך ולמקם אותם בשכונה לשימוש מאוחר יותר.

3. בידוד של גזע המוח שמיעתית עוף

1. מניחים ביצה תחת מקור אור בהיר על מנת לקבוע את חלל מלא באוויר הריק של העובר (בדרך כלל הצד גדול של הביצה).
2. הפסקת פתוח בצד גדולות של ביצה חשיפת שק קרום. בצע פרוסה בקרום שק עם אזמל בעדינות להסיר את ראשו של העובר עוף.
3. במהירות לערוף את הראש עם מספריים.
4. המקום קצה סכין גילוח האחורי מעט אל בין העיניים. ביצוע חתך מקורי ל-הזנב קו האמצע דרך הגולגולת החלים רק לחץ קל *.
   * טיפ: הלחץ המופעל תלוי גיל העובר (כלומר, הצעיר = פחות, ישנים יותר =)
5. דחף בעדינות הצידה עור ונוצות לחשוף את הגולגולת לאמת חתך קו האמצע.
6. בלוק חלק מקורי של הגולגולת על ידי חיתוך בסכין גילוח. להב מיקום אחורי אל העיניים לחתוך במהירות דרך הגולגולת כולו ברקמת המוח *.
   * טיפ: לחץ חזק נדרשת להסיר לחלוטין קטע מקורי.
7. הפוך את קו האמצע אל לרוחב חתכים עם מספריים קטנים באזור הזנב של הגולגולת, קדמית מעט שרירי הצוואר לעין משני צדי הראש. משוך ממנו הגולגולת רקמת לחשוף את המוח הקטן והמוח.
8. להסיר בעדינות את המוח מבסיס הגולגולת על ידי חיתוך הרקמה מחוברת עם מספריים קטנים. לאחר כל רקמה נחתכת, המוח צריך לנוע בחופשיות מן הגולגולת *.
   * טיפ: ייתכן שיהיה עליך להפוך את הגולגולת (את המוח) לחתוך רקמות המצורפת.

4. הכנת המוח עבור בחותכו

1. הוסר לאחר מהגולגולת, סיכת המוח למטה דרך tecta אופטיים.
2. להסיר לחלוטין את המוח הקטן בעדינות על ידי חיתוך peduncles עם מספריים קטנים, לחשוף את רצפת החדר הרביעי.
3. הסר את כל הרקמה הקרומית ואת כלי הדם מפני השטח של גזע המוח עם פינצטה ולבצע קיצוץ רוחבי דרך tecta אופטיים לבודד את גזע המוח.
4. מניחים כמות קטנה של דבק סופר על הבמה vibratome מול לחסום את אגר (לכיוון הלהב vibratome).
5. בעזרת פינצטה, בעדינות ובמהירות להרים את המוח על חוט השדרה וברקמות מקום על דבק סופר עם הצד מקורי למטה בצד הגבי כלפי ללהב vibratome *.
   * טיפ: דבק עודף צריכה להיספג עם קים, למחות או מסנן נייר לפני הצעד הבא.
6. בעדינות יוצקים ACSF מחומצן לשלב vibratome *.
   * הערה: זה יכול להיות ACSF מבעבע ברציפות עם O ₂ / CO _2. עם זאת, מבעבע של ACSF בהיקף כה קטן של תוצאות הפתרון בתנועה בלתי רצויות (ונזק אפשרי) על פרוסות המוח. אם מבוצע במהירות, כבר מחומצן ACSF מ דיסקציה היא מספקת.
7. להב Vibratome צריכה להיות בזווית של 20-22 מעלות. התחל vibratome (תנודה צריך להיות מוגדר על אמפליטודה מקסימלית) ולעבור שלב לכיוון הלהב כך את החלק העליון של רקמת מקביל עם להב לפני חיתוך.
8. לעבור במהירות להב כלפי רקמת המוח. האט משמעותית לקראת פשוט ליצור קשר עם להב רקמות.
9. בגין חיתוך הרקמה בתנועה קדימה האיטי ביותר האפשרי. לאחר קטע דרך העטרה כולה של רקמה, להזיז בעדינות פרוסה מן הלהב בעזרת מברשת או זכוכית שבורה, ירה פיפטה מלוטש, מתאים בקצה אחד עם נורת גומי.
10. בשלב התחתון של 300-500 צעדים מיקרומטר ו פרוסה שוב. חזור על הפעולה עד חתימות אנטומיים ניכרים ברקמת המוח. בשלב זה, גזע המוח פרוסת רקמה המכילה מבנים שמיעתי ב 200-1000 מיקרומטר עובי, בהתאם לגילו של צרכים רקמות ניסיוני.
11. בזהירות לשמור על פרוסות שמיש הסדר של חיתוך, כלומר, פרוסה 1 ^st מייצג את אזור הזנב ביותר של המעגל (צליל בתדר נמוך עיבוד) וגם את הפרוסה האחרונה מייצגת את קטע מקורי ביותר (בתדירות גבוהה processing) *.
    * הערה: עבור מיקום של פרוסות לשימוש תרבות, עבור לפרק 6. עבור אחסון הפיזיולוגיה חוץ גופית, ראה בסעיף הבא.

5. פורסים אחסון עבור חוץ גופית פיזיולוגיה

1. בהתאם לגיל העובר עוף ואת עובי של הפרוסה, כל חיה צריך לספק 1-6 פרוסות.
2. בעדינות במקום פרוסות בודדים בתא באמצעות זכוכית מלוטשת אש פיפטה מצויד בקצה אחד עם נורת גומי. לשכת צריכים להיות ממוספרים. המקום רק פרוסה אחת לכל היטב, על מנת לשמור על כמה סגוליות tonotopic (למשל, פרוסת הזנב ביותר בתא 1 ואת פרוסת מקורי ביותר בתא האחרון). לשכת צריכים להיות מלאים ACSF ו מבעבע ברציפות בתערובת של 95% O ₂ / 5% CO ₂ (pH 7.4, osmolarity 295-310 mOsm / ליטר).
3. אפשר פרוסות לאזן על ידי הצבת חדר לתוך אמבט חמים (36 מעלות צלזיוס) במשך שעה בערך 1.
4. הסר קאמרית מן אמבטיה חמה ולאפשר לנוח בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי בערך.
5. אחרי שעה וחצי בטמפרטורת החדר, פרוסות ניתנת להעברה מחדר מחזיק תא ~ 0.5 מ"ל הקלטה רכוב על מיקרוסקופ לניסויים אלקטרו.
6. פרוסות יכול לשמש עד ~ 6 שעות לאחר הסרת מן האמבט החם.

6. הכנת תרבויות Slice Organotypic ⁸

1. מיד לאחר הליך חיתוך (ראה סעיף 6) פרוסות להעביר עם ACSF 500 ~ μL באמצעות זכוכית מלוטשת אש פיפטה מצויד בקצה אחד עם נורת גומי לצלחת 48 היטב על קרח. פרוסה אחת לכל טוב *.
   * טיפ: Slices צריך להיות לפחות 300 מיקרומטר עד 1000 מיקרומטר עבה.
2. לאחר פרוסות נאספו, להעביר את צלחת 48-היטב למכסה המנוע.
3. הסרת 6-המכיל גם צלחת תרבות בינוני מתוך החממה ולהעביר אותו אל מכסה המנוע.
4. רק לפני הנחת פרוסות מהמוח יחיד על ממברנות, מקום אחד מוסיף קרום מוכן (ראה סעיף 2.2) לתוך באר עם המדיום לתרבות. ודא שאין בועות אוויר נמצאים תחת קרום.
5. בעזרת פיפטה כוס, העברת פרוסה ירידה של ACSF על הממברנה תרבות להסיר ACSF עודף עם micropipette. חזור עבור שאר פרוסות (מקסימום 4 פרוסות לכל ממברנה) *.
   * טיפ: ודאו פרוסות לא נוגעים זה בזה ופרוסות מקום מרכזי על הממברנה, כך שהם לא נוגעים שפת הממברנה.
6. חזור על פרוסות המוח כמו רבים לפי הצורך *.
   * טיפ: אם התרבויות הם מניפולציה בשלב מאוחר יותר, זה יכול להיות יתרון להגביל את כמות ממברנות עד 3 לכל צלחת 6 גם כדי להפחית את הזמן התרבויות יוסרו מן החממה.
7. שינוי התרבות בינוני 3 פעמים בשבוע מתחת למכסה המנוע: הסר בינוני ישן עם צינורית ואקום עם קצה סטרילית תוך הוספת קרום הוא הרים את הבאר עם זוג מלקחיים. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבות טרי גם בעוד להכניס קרום מורם מתוך הבאר. כאשר כל מדיום הוא שונה, לשים צלחת בחזרה לתוך החממה.

7. נציג תוצאות:

באיור 1. המעגלים binaural של גזע המוח השמיעתית עוף. (א) סכמטי של קטע העטרה ו (BF) חוץ גופית תמונות פרוסת גזע המוח השמיעתית עוף. מעגל ב (א) מראה תשומות הגירוי מביא מתוך עצב השמיעה () לגרעין magnocellularis (NM) ואת גרעין angularis (NA). NM פרויקטים תשומות הגירוי הבילטרלי לגרעין laminaris (NL) על שני הצדדים של גזע המוח. הקלט מעכבות מן מעולה (בנו) פרויקטים olivary גרעין כדי NA, NM ו NL. חוץ גופית פרוסות (BF) הם תמונות רציפים (200 מיקרומטר אחד) הולך מן הזנב (ב) על מקורי (F) של גזע המוח השמיעתית עוף, המייצג את נמוך לתדר גבוה אזורים, בהתאמה. המעגלים אחראי על קידוד נכסים זמני של קול בשימוש בעיקר עבור לוקליזציה קול. בר סולם ב (B) = 500 מיקרומטר ו חל על תמונות (CF). חצים בנקודה (ד ') את שכבת התאים בגוף יחיד של NL.

איור 2. נוירונים בתרבית לפתח נורמלי מאפייני התגובה פיזיולוגי. מעל כל השינויים מתח הממברנה בתגובה hyperpolarizing ו depolarizing השלבים הנוכחיים של חריפה (A & C) בתרבית רקמה על 4 (ב) ו -7 (ד) ימים בתרבות (DIC). הערה שינויים hyperpolarizing "לשקוע" מתח, ירידה חזקה הנוכחית כלפי חוץ, ועל אחת ירי AP כי לפתח דומה בגישה תרבות פרוסה לעומת רקמת הגיל המקבילה חריפה. זריקות נוכחי היו 200 ms, צעדים של הרשות 50-100. RMPs היו בין -55 ו -60 mV.

איור 3. המבנה האנטומי של SLI תרבותCES. המחצית השמאלית של המוח השמיעתית של עוף E11 לאחר 7 ימים בתרבות (DIC). נוגדנים כנגד חלבון microtubule הקשורים 2 (MAP2), אשר מתרחשת סומה ו דנדריטים, מסומן בירוק. מקבץ של גרעין magnocellularis (NM) נוירונים האקסונים שלה מסומנים באדום דרך electroporation של dextran אלקסה לצבוע. שני NM וקו תא NL גלויים. Ipsilateral מסופי האקסון NM ניתן לראות מקרין על דנדריטים הגב NL (ראשי חץ לבן).

Discussion

במשך כמה עשורים, להכנת פרוסה חריפה של גזע המוח עוף שימש ללמוד עיבוד שמיעתי ^{9, 10.} גישה זו סיפקה כמות עצומה של חוץ גופית נתונים פיזיולוגיים על עיבוד binaural משני מצבים התפתחותיים בוגרת ^{4, 11, 12.} הרבה ידוע על המעגל הזה מאוד מיוחדים ואת תפקיד גרעין כל משחק בעיבוד הזמני של ^{13 קולות, 14.} למעשה, בטווח הקצר מניפולציות ניסיוני והשפעתם על המבנה והתפקוד של מעגל זה מאופיין היטב הוכיחו יתרון ^15. מנקודת מבט ארוכת טווח התפתחותי עם זאת, מניפולציות כאלה אינם אפשריים וטכניקות כדי לטפל בבעיה זו הם ערובה. כאן אנו מציעים שיטה חדשנית המספקת את ההזדמנות כדי לחקור שאלות כאלה. בסופו של דבר, תרבויות פרוסה organotypic לספק את האפשרות לתמרן הפעילות הסינפטית, תקנות ערוץ מהותי, תגובות קולטן postsynaptic, ואת ההפרש ביטוי גנים ספציפיים על פני תקופות ארוכות התפתחותית. גישה זו תהיה נוספת לבנות על הידע הנרחב של המעגל שמיעתי עוף טוב לסייע למדענים בהבנת שאלות בסיסיות על פיתוח הנוירוביולוגי.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Chicken ACSF
NaCl		Fisher Scientific	M-11624	130 mM
NaHCO3		Fisher Scientific	M-10576	26 mM
KCl		Sigma-Aldrich	P-9333	3 mM
NaH2PO4		Sigma-Aldrich	S-8282	1.25 mM
Glucose		Sigma-Aldrich	G-7528	10 mM
MgCl2		Fisher Scientific	M33-500	1 mM
CaCl2		Acros Organics	423525000	2 mM
Chicken culture medium (store at 4°C)
advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)		GIBCO, by Life Technologies	12492-013	48.00%
Earl’s balanced salt solution		Sigma-Aldrich	E-2888	24.00%
L-glutamine (200 mM)		Sigma-Aldrich	G-7513	1.00%
Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	G-7528	2.75%
horse serum (heat inactivated, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	H-1138	24.00%
Penicillin-streptomycin*		Sigma-Aldrich	P-0781	1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination
Specific equipment
Millicell-CM cell culture inserts	PICMORG50	EMD Millipore
6-well plate	6 Well Cell Culture Cluster	Corning
Incubator	Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific