En Orthotopic Modell av murina blåscancer

Summary

Tumörer i urinblåsan är etablerade i honmöss i ett minimalt invasiva sätt genom kateterisering, lokala kauterisation, och efterföljande vidhäftning av cancer celler till bränna webbplatser.

Abstract

I detta enkla förfarande, är tumörer i urinblåsan är etablerad i kvinnliga C57 möss med hjälp av kateterisering, lokala kauterisation, och efterföljande celladhesion. Efter deras blåsorna är transurethrally kateter och avrunna, är djur igen kateter för att möjliggöra införandet av en platinatråd i blåsor utan att skada urinröret eller urinblåsan. Den katetrar är gjorda av teflon för att fungera som en isolator för wire, som kommer att utföra elektrisk ström in i urinblåsan för att skapa en brännskada. En diatermi enhet används för att leverera 2,5 W för att den exponerade änden av kabeln, brinnande bort extracellulära lager och ge fastsättning platser för cancer celler som levereras i suspension till urinblåsan genom ett efterföljande kateter. Celler kvar i urinblåsan i 90 minuter, varefter katetrar tas bort och blåsor får rinna naturligt. Utvecklingen av tumören övervakas via ultraljud. Särskild uppmärksamhet fästs vid kateterisering tekniken i den medföljande videon.

Protocol

1. Djur

1. Kvinna C57BL/6J möss (Mus musculus) är verifierade fria från smittsam ektoparasiter, helminth endoparasiter, och antikroppar mot 17 murina virus av säljaren före leverans. Möss är inrymt i AAALAC-ackrediterade djur anläggning av Tulane University i enlighet med Guide för skötsel och användning av försöksdjur. ¹
2. Specifikt möss grupp inhysta (4-5 möss / bur) i individuellt ventilerade polykarbonat cageswith microisolation filter toppar på hårda sängar. De tillhandahålls ad lib gnagarpellets mat och kranvatten.
3. Möss får 7 dagar för att acklimatisera sig innan studien.

2. Celler

1. Den murina denna cancerform cellinje MB49 används för att producera tumörer i urinblåsan.
2. Cellerna odlas i Dulbecco ändrade Eagle på medellång kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 100 enheter / ml penicillin, och 100 enheter / ml streptomycin.
3. Kulturer hålls vid 37 ° C och 5% CO ₂ med media ändras varje två till tre dagar.

3. Animal Orthotopic tumör Modell

Den instillation i urinblåsan tumören modell som beskrivs här är en modifiering av det förfarande som beskrivs av Gunther et al. ²

1. Anestesi induceras med 2% isofluran (MWI / VetOne, Meridian, ID, Cat # 501.017) i syre och underhålls på 0,75-1,25%. (Flera djur kan behandlas samtidigt, vilket skulle kräva en ökning av isofluran nivåer.) För att förhindra hornhinnan torkning, är ögonen smörjs med en konstgjord tårar oftalmologiska salva. Kroppsvärmen underhålls med en uppvärmd pad under ett papper drapera.
2. Pälsen på nedre delen av ryggen är klippt för att främja kontakt med metallen jordning plattan, och det rakade området är täckt med electroconduction gel.
3. Varje mus är sedan individuellt placeras i dorsal recumbancy på en metall jordning tallrik, och urinblåsan är kateter transurethrally med hjälp av en smord 24-gauge, 3 / 4 tum, over-the-nål IV kateter med den borttagna stylet.
4. Urinblåsan är tömd på urin, och en platinatråd förs in genom kateter i urinblåsan lämnar blottade ledningar på vardera änden av katetern - cirka 2 mm på lumenal änden av katetern. Tråden är gjord av platina på grund av motstånd av materialet till oxidation.
5. En 2,5 W aktuella tillämpas sedan till urinblåsan för cirka 0,5 sekunder genom att röra vid den yttre delen av kabeln med en diatermi enheten inställd på koagulationen.
6. Tråden är då flyttas till en annan plats i urinblåsan och en annan 2,5 W avgift tillämpas.
7. Tråden tas bort, och 100 ìl MB49 celler vid en koncentration på 1x10 ⁶ celler / ml är ingjutit via kateter in i urinblåsan via en 1 ml spruta.
8. Sprutorna lämnas kvar i katetern för att förhindra utflöde av cellsuspensioner och kateter möss bevaras under narkos i 90 minuter så att de celler att fästa till bränna webbplatser.
9. 100-200 l steril koksaltlösning administreras av IP injektion till varje mus före återvinning.
10. I slutet av inkubationstiden för katetrar tas bort och djuren har möjlighet att återhämta sig på den uppvärmda plattan tills rätande reflexer tillbaka, som peka på möss är tillbaka till sitt hem burar.

4. Ultraljud

1. Tumörer tillåts växa i 3-5 dagar innan mössen genomgå ultraljudsundersökning av urinblåsan för att övervaka tumörtillväxt.
2. För det första ultraljudsundersökningar, djuren bedövas enligt ovan. Möss är placerade i rygg recumbancy och bukhuden bereds genom att klippa pälsen.
3. En 24 gauge intravenös kateter sätts transurethrally in i urinblåsan. Vid denna punkt kan blåsan tömmas och urinen samlas upp för vidare analys.
4. 100 l av steril koksaltlösning är i urinblåsan via kateter för att förbättra urinblåsan synlighet på ultraljud.
5. Ultraljud överledning gel appliceras på buken och ultraljud utförs för att bedöma urinblåsans vägg och lumen.

5. Representativa resultat:

Tumörvävnad kommer att börja visas 3-5 dagar efter innoculation. Vår erfarenhet är i en grupp av 12 möss, 50% eller mer rutinmässigt har en påvisbar vävnad massa inom urinblåsan (0,5 - 1,0 l, med hjälp av V = π / 6 · L · W · H) per dag fem. Vid användning av MB 49 celler, kommer tumörer att växa och eutanasi kommer att krävas för dag 24 om mössen går obehandlade. Eutanasi rekommenderas när mössen blir slö eller kakektiska, visa ruggig päls, hunching och icke-känslig beteende, eller när de förlorar 20% av sin ursprungliga kroppsvikt. </ P>

Den tumörer växer snabbt och kommer att ha nekrotisk center efter att de når en massa av 200 mg eller mer, ³ skenbart eftersom cellerna i utvecklingsländerna tumören föröka sig snabbare än vad som kan servas av den angiogena blodtillförsel. Man kan också indirekt övervaka tumörprogression via nivå hematurea, vilket förmodligen har samband med snabb angiogenes inom utveckling av tumörer. Det var genomgående noteras att urinen hos obehandlade tumör-bärande möss innehöll blod efter dag 14. Koncentrationen av röda blodkroppar tycktes öka över tiden i dessa möss, och mängden urin minskar. Tumörer som överstiger 50 mg kan också palperas med relativ lätthet, vanligtvis med 14 dagar efter innoculation.

Discussion

Den här minimalt invasiva metoden för att fastställa orthotopic tumörer i urinblåsan i honmöss kan även tillämpas för celltyper än MB49, trots skilda resultat kan förväntas. När mindre aggressiva tumörceller används kommer att öka effekt något (med 0,5 W steg att upprätta det nya optimala) ger ett område mer mottaglig för tumörceller kvarstad, och längre urinblåsan inkubationstiderna för ingjutit cellerna kommer att ge en större mängd cellbindning vid bränner webbplatser (opublicerade data). Även om vissa protokoll rekommenderar att leverera 10 W via diatermi, ² denna mängd energi bör betraktas som en övre gräns, och kanske undvikas helt. Öka koncentrationen av levererade celler kan också öka chanserna att lyckas när andra celltyper används.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J mice	Jackson Laboratory	000664	3-5-wk-old
Polycarbonate cages and ventilated rack	Lab Products	Super Mouse 750	327mm x 190mm x 143mm
Hardwood Bedding	Harlan Laboratories	Laboratory –grade SaniChips
Rodent diet	Harlan Laboratories	Rodent Diet 2019
IV Catheter	MWI Veterinary Supply	009231	24 G x ¾ in.
Electrocautery unit	Bovie Medical Corporation	Aaron 900
Ultrasound unit	Sonosite	180 Plus (Vet)
MB49 cell line	Wake Forest University Baptist Medical Center	N.A.
DMEM	Invitrogen	21063-029
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products	100106 500A57B
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-163