Summary
Un test simple pour mesurer les effets sédatifs de l'éthanol sur
Abstract
De faibles doses d'éthanol provoquer des mouches pour devenir hyperactif, tandis que des doses élevées sont sédatifs. La sensibilité à l'éthanol induit une sédation d'une souche donnée volée est corrélée avec la préférence d'éthanol que la souche S, et donc la sédation est une mesure très pertinente pour étudier la génétique des réponses d'alcool et de boire. Nous démontrons un moyen simple d'exposer des mouches à l'éthanol et mesurer ses effets enivrants. Le test que nous décrivons peut déterminer la sensibilité aiguë, ainsi que la tolérance éthanol induite par une exposition répétée. Il ne nécessite pas une configuration technique impliqués, et peuvent donc être appliquées dans n'importe quel laboratoire avec les outils de base de la culture voler.
Protocol
1. Créer la chambre d'exposition
- Couper un bouchon de flacon de moitié l'aide d'une lame de rasoir. Sinon, utiliser des balles de coton.
- Poussez la moitié prise flacon ou la boule de coton, au fond d'un flacon de nourriture pour faire une surface lisse qui vole sera pas coincé po
- Si vous faites des chambres d'exposition multiple, assurez-vous que la fiche du flacon et de la nourriture prennent le même volume dans chaque chambre. Une marque sur le côté du flacon peut faciliter ce processus.
2. Exposer les mouches
- Collecter 8 mouches d'un sexe, d'âge 1-5 jours, la veille de l'exposition dans des flacons nourriture régulière, sans levure.
- Les étiqueter dans le code, tels que l'expérimentateur est aveuglé au génotype réel / souche utilisée.
- Transfert des huit mouches dans les chambres de l'exposition en appuyant sur. Ne pas anesthésier.
- Ajouter une petite quantité de colorant alimentaire, par exemple l'acide bleu 9, à 200 d'éthanol la preuve pour le rendre facilement visible.
- Napper le fond d'un plug flacon, ou boule de coton, avec 0,5 ml d'éthanol.
- Insérez la fiche d'éthanol dans le flacon de l'exposition. Assurez-vous que l'alcool est confronté dans le flacon, et non pas vers la paroi du flacon.
- Démarrer un compte à rebours jusqu'à.
3. Enregistrement d'éthanol-intoxication
- Chaque minute après le chronomètre est lancé, appuyez sur la chambre d'exposition sur le banc pour faire sursauter les mouches et les observer pendant dix secondes.
- Notez le nombre de mouches stationnaires pour chaque minute. Les mouches sont stationnaires si elles ne peuvent pas sortir leur dos, rester dans un endroit, ou rapidement vibrer leurs ailes à travers l'ensemble de dix secondes d'observation période. Les mouches derniers sont considérés comme stationnaires car la grande majorité de ces mouches sont stationnaires entre les périodes de mouvement d'ailes rapides. Les mouches ne sont pas stationnaires si elles peuvent obtenir sur leur dos et de pied et / ou sur le mur du flacon.
- Un essai d'exposition est terminée lorsque 4 ou plus de mouches sont enregistrés comme stationnaire.
- Jeter les mouches et laissez l'air chambre d'exposition à pour une réutilisation ultérieure.
4. Déterminer le temps de la sédation de 50%
Le temps d'une sédation de 50% (ST50) est le temps après le début de l'exposition à l'éthanol, alors que quatre des huit mouches restent stationnaires. Ceci est déterminé comme suit:
Soit: la minute la première mesure où exactement quatre mouches sont stationnaires.
Ou: si moins de quatre mouches (Y1) sont stationnaires à un moment donné du temps (minute X), et plus de quatre (Y2) au point de mesure du temps suivant (minute X +1), puis interpoler linéairement du ST50 en utilisant la formule:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X
5. Répétez l'exposition afin de déterminer la tolérance
Exposer les mouches
- Déterminer le ST50 (en poids) pour la souche contrôle sauvage utilisé dans votre expérience.
- Exposer les groupes expérimentaux de mouches à l'éthanol comme décrit ci-dessus.
- Mesurer leur ST50 (1), mais continuer à exposer jusqu'à l'époque 2x ST50 (en poids).
- Transférer les mouches de nouveau dans une fiole de nourriture vides, et tenir pendant 4 heures.
- Re-exposer les mouches, et de déterminer le ST50 (2) de l'exposition 2.
Déterminer la tolérance
Calculer la tolérance en% en (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100.
6. Les résultats représentatifs:
Montré ici, quelques résultats représentatifs, nous avons obtenu avec 6-8 flacons de mouches par le génotype et la dose. Si votre erreur standard est sensiblement plus grand, puis un problème systématique s'est probablement produite. Assurez-vous que l'éthanol visages dans les chambres de l'exposition, et que les chambres sont au même volume.
Figure 1. Courbe dose-réponse de type sauvage mouches exposées à des pourcentages croissants d'éthanol. Huit flacons de mouches ont été exposées par dose et le sexe. Mouches mâles et femelles montrent le ST50 même à chaque dose (p> 0,22, 2-way ANOVA), tandis que le ST50 travers doses diminue considérablement avec la dose d'éthanol augmente (p <0,001). Notez que les mouches à partir surpeuplés bouteilles peuvent être sensiblement plus petits que ceux à partir de bouteilles en bonne santé, et cette différence de taille peut affecter le ST50. Semences chaque bouteille avec des femelles de 15 à 20 de pose de 1-2 jours pour obtenir la densité larvaire optimale par bouteille.
Figure 2. Exposer mouches soit de l'éthanol à 90%, ou 100% reproduit le décrit précédemment éthanol-résistance provoquée par le blanc rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-way ANOVA).
Figure 3. Répétez l'exposition à l'éthanol 100%, espacées par un intervalle de récupération de 4 heures, provoque une augmentation significative de la ST50 après la seconde exposition (p <0,001, t apparié-Test). Notez que les mouches ont été exposées pendant 24 minutes pendant la première exposition (correspondant à deux fois leur ai na ST50). D'exposition pour un court laps de temps (12 minutes) n'a pas provoqué une augmentation significative du ST50 sur la ré-exposition (données non présentées).
Discussion
Dans cette présentation, nous avons défini une méthode simple pour déterminer l'éthanol intoxication volontaire basée sur des essais antérieurs décrits par Bainton et al. 2000 1, et Rothenfluh et al. 2006 2. Puisque l'alcool sédation induite est corrélé avec la préférence boire de l'alcool 3, ce test est pertinent pour l'étude des troubles liés à l'alcool. Le test décrit est basé sur sursaut induite géotaxie négative, et comment une exposition à l'alcool interfère avec cette réponse innée. Avant de commencer l'exposition, vérifiez que tous vos mouches montrent une réaction normale à un tel sursaut, c'est à dire après avoir appuyé sur le bas les mouches dans le flacon alimentaires, ils devraient tous passer du fond dans un délai de 10 secondes d'observation. Exemples de mouches ayant réduit géotaxie négatifs comprennent la saisie des mutants sensibles bang-5, et la locomotion déficientes mouches causée par la dégénérescence des neurones dopaminergiques 6.
Même si le dosage décrit est relativement simple, deux variables méritent le plus d'attention afin d'assurer des résultats reproductibles. D'abord, tous les flacons de l'exposition devrait être le même volume. Cela comprend en s'assurant que le fond du flacon contenant le même volume de nourriture + flacon Plug / coton balle, ainsi que d'insérer la fiche contenant de l'éthanol à la même distance pour chaque flacon. Un flacon complètement vide peut être utilisé pour ce test, mais elle conduit à des valeurs plus ST50, en diminuant le débit de l'essai.
Ce test est également approprié pour déterminer la quantité de mouches de tolérance se développer après exposition à l'éthanol répéter. Un certain nombre de variables doivent être considérés lorsque vous faites des expositions répétées. Tout d'abord, l'intervalle entre l'exposition est ici décrit comme 4 heures. Cette variable peut être changé, mais nous recommandons de ne pas être inférieure à 2 heures, pour assurer un dégagement d'éthanol à partir de la première exposition. Voir Scholz et al. 2000 4 pour la cinétique de développement tolérance à l'éthanol et de décadence. La seconde variable à considérer est la durée de la première exposition. Ceci a évidemment être le même pour le contrôle et les mouches expérimental. Toutefois, cela peut ne pas aboutir à la même quantité d'éthanol livré à ces deux souches voler. Mouches Sedated absorber plus d'éthanol que les mouches actif 2, donc une souche qui endort tôt peuvent recevoir une dose supérieure à une souche plus tard, sédatifs, et ainsi développer plus de tolérance en raison d'une dose initiale plus élevée. Nous fermement en garde le lecteur lorsque l'on compare le développement de souches de la tolérance qui montrent des différences dans le ST50 initiale (1).
Le test que nous décrivons ici est un outil utile pour facilement et de façon reproductible la détermination des réponses comportementales des mouches à l'alcool.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions Aylin Rodan pour la lecture critique du manuscrit, et des membres du laboratoire de discussion utile. Cette recherche est soutenue par le NIH, R01AA019526.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exposure vials | www.flystuff.com | 32-116 | |
| Plugs | www.flystuff.com | 49-102 | |
| Acid Blue 9 | Sigma-Aldrich | 861146 |
References
- Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
- Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).
