Ett enkelt sätt att mäta Etanol känslighet i Flugor

Summary

En enkel analys för att mäta de sederande effekterna av etanol på

Abstract

Låga doser av etanol orsakar flugor att bli hyperaktiva, medan höga doser lugnande. Känsligheten för etanol-inducerad sedering av en viss fluga stam är korrelerad med den stam är etanol önskemål, och därför sedering är en mycket viktig åtgärd för att studera genetiken av alkohol svar och dricka. Vi visar ett enkelt sätt att exponera flyger till etanol och mäta dess berusande effekter. Analysen beskriver vi kan bestämma akut känslighet, samt etanol tolerans induceras av upprepad exponering. Det kräver inte ett tekniskt involverad setup, och kan därför tillämpas på alla laboratorier med grundläggande verktyg flyga kultur.

Protocol

1. Skapa exponeringskammare

1. Skär en injektionsflaska plugin i hälften med hjälp av ett rakblad. Du kan också använda bomullstussar.
2. Tryck halv flaska kontakten, eller bomullstuss, till botten av ett livsmedel injektionsflaska att göra en slät yta som flugorna inte kommer att fastna i.
3. Om du gör flera exponering kamrar, se till att flaskan kontakten och mat tar upp samma volym i varje kammare. Ett märke på sidan av injektionsflaskan kan underlätta detta.

2. Exponera flugorna

1. Samla 8 flugor i en kön, ålder 1-5 dagar, dagen innan exponeringen på vanlig mat flaskor utan jäst.
2. Etikettera dem i kod, så att försöksledaren är blinda för den verkliga genotyp / stam som används.
3. Överför åtta flyger in i exponeringen kamrarna genom att knacka på. Inte söva.
4. Tillsätt en liten mängd mat färg, t ex Acid Blue 9, till 200 bevis etanol för att göra den väl synlig.
5. Täck botten av en flaska plugg eller bomullstuss med 0,5 ml etanol.
6. Sätt etanol kontakten i exponeringen flaskan. Se till att alkoholen är vänd in i flaskan, och inte mot väggen i flaskan.
7. Starta en timer som räknar uppåt.

3. Rekord etanol-inducerad berusning

1. Varje minut efter att timern är igång, tryck på exponeringskammare på bänken för att skrämma flugorna och observera dem i tio sekunder.
2. Registrera antalet stationära flugor för varje minut. Flugor är stationära om de inte kan få upp sina ryggar, kvar på en plats eller snabbt vibrera med vingarna i hela tio andra iakttagelsen-period. De senare flyger anses stationära eftersom den stora majoriteten av dessa flugor är stationära mellan perioder av snabb vinge rörelse. Flugor är INTE stillastående om de kan få upp sina ryggar och promenad och / eller upp flaskan väggen.
3. En exponering rättegång är klar när 4 eller fler flugor redovisas som stationära.
4. Kasta flugor och låt luften exponeringskammare ut för senare återanvändning.

4. Bestäm tid till 50% sedering

Tiden till 50% sedering (ST50) är den tid efter starten av etanol exponering när fyra av de åtta flugor stå stilla. Detta bestäms enligt följande:
Antingen den första mätningen minuten när exakt fyra flugor är stationära.
Eller: om mindre än fyra flugor (Y1) är stationära vid en tidpunkt (minut X), och mer än fyra (Y2) vid nästa mätning tidpunkt (minut X +1), därefter linjärt interpolera de ST50 med formeln:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X

5. Upprepad exponering för att avgöra tolerans

Exponera flugorna

1. Bestäm ST50 (WT) för vildtyp kontroll stam som används i experimentet.
2. Exponera experimentella grupper flyger till etanol enligt beskrivningen ovan.
3. Mäta sina ST50 (1), men fortsätter att utsätta tills du når den tid 2x ST50 (WT).
4. Överför flyger tillbaka till en tom mat flaskan och håll i 4 timmar.
5. Re-utsätta flugor, och bestämma ST50 (2) exponering 2.

Bestäm tolerans

Beräkna tolerans i% som (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100.

6. Representativa resultat:

Visas här, är några representativa resultat fick vi med 6-8 injektionsflaskor med flugor per genotyp och dos. Om din standard fel är betydligt större, då ett systematiskt problem uppstått troligt. Se till att etanol ansikten i exponering kamrar, och att kamrarna är samma volym.

Figur 1. Dosresponskurvan av vild typ flugor som utsätts för allt större andel av etanol. Åtta flaskor av flugor utsattes per dos och kön. Manliga och kvinnliga flugor visa samma ST50 vid varje dos (p> 0,22, 2-vägs ANOVA), medan ST50 över doser minskar markant med ökande etanol dos (p <0,001). Observera att flyger från överbefolkade flaskor kan vara betydligt mindre än de från friska flaskor, och denna storlek skillnad kan påverka ST50. Seed varje flaska med 15-20 kvinnor om i 1-2 dagar för att få optimal larver täthet per flaska.

Figur 2. Exponera flyger till antingen 90% eller 100% etanol återger den tidigare beskrivna etanol-resistens som orsakats av den vita rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-vägs ANOVA).

Figur 3. Upprepa exponering för 100% etanol, placerade med en 4 timmars återhämtning intervall, orsakar en betydande ökning av ST50 efter andra exponering (p <0,001, parade t-Test). Observera att flugorna exponerades under 24 minuter under den första exponeringen (motsvarande två gånger sin na har ST50). Exponering för en kortare tid (12 minuter) inte orsaka en betydande ökning av ST50 efter förnyad exponering (data visas inte).

Discussion

I denna presentation har vi sammanställt ett enkelt sätt att avgöra etanol-inducerad berusning baserade på tidigare analyser som beskrivs av Bainton et al. 2000 ^1, och Rothenfluh et al. 2006 ^2. Eftersom alkohol-inducerad sedering är korrelerad med alkohol dricker föredrar ^3, är detta test är relevanta för studier av sjukdomar alkohol. Analysen som beskrivs bygger på skrämsel-inducerade negativa geotaxis, och hur en alkohol exponering stör denna medfödda svar. Innan exponeringar, se till att alla dina flugor visar en normal reaktion på en sådan skrämma, dvs efter att knacka ner flugor i maten flaskan, bör de alla flytta upp från botten i en 10 sekunders observationstid. Exempel på flugor som har minskad negativ geotaxis inkluderar bang-känsliga beslag mutanter ^5, och rörelseorgan-brist flugor orsakas av degeneration av dopaminneuron ^6.

Även om den beskrivna analysen är relativt enkel, två variabler förtjänar mest uppmärksamhet för att säkerställa reproducerbara resultat. Först bör alla exponeringen flaskor vara samma volym. Detta inkluderar att se till att botten av flaskan innehåller samma mängd mat + injektionsflaska plug / bomullstuss, samt att sätta in etanol innehåller plugg samma avstånd för varje flaska. En helt tomma flaskan kan användas för denna analys, men det leder till längre ST50 värden, minskar genomströmningen av analysen.

Denna analys är också lämpligt att fastställa beloppet av tolerans flugor utvecklas vid upprepad etanol exponering. Ett antal variabler bör beaktas när man gör upprepade exponeringar. För det första är mellan exponeringen intervallet här beskrivas som 4 timmar. Denna variabel kan ändras, men vi rekommenderar det inte vara lägre än 2 timmar, för att säkerställa clearance av etanol från den första exponeringen. Se Scholz et al. 2000 ⁴ för kinetiken av etanol tolerans utveckling och förfall. Den andra variabeln att tänka på är längden på den första exponeringen. Detta har givetvis vara samma för kontroll och den experimentella flugor. Detta kan dock inte resultera i samma mängd etanol som levereras till båda dessa flyga stammar. Sederade flugor absorberar mer etanol än aktiva flyger ^två, alltså en stam som sedates tidigare kan få en högre dos än senare-sederande stam, och därigenom utveckla mer tolerans på grund av en högre initial dos. Vi försiktighet starkt läsaren när man jämför tolerans utveckling av stammar som visar skillnader i den initiala ST50 (1).

Analysen beskriver vi här är ett användbart verktyg för att enkelt och reproducerbart bestämma flyger beteendemässiga reaktioner på alkohol.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Exposure vials	www.flystuff.com	32-116
Plugs	www.flystuff.com	49-102
Acid Blue 9	Sigma-Aldrich	861146