Summary
हम तंत्रिका तंत्र की अभिव्यक्ति रूपरेखा के लिए डीएनए का उपयोग प्रदर्शित करता है. हम शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण, नमूना लेबलिंग, और सरणी संकरण और स्कैनिंग का वर्णन करता है.
Abstract
माइक्रोएरे अभिव्यक्ति की रूपरेखा तंत्रिका तंत्र के विकास के विभिन्न चरणों, अलग शारीरिक या रोग राज्यों, उपचार के लिए प्रतिक्रिया में जीन गतिविधियों की पहचान करने और सामान्य रूप में, किसी भी शर्त है कि प्रयोगात्मक जा रहा है एक परीक्षण के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है. तंत्रिका ऊतकों की अभिव्यक्ति रूपरेखा उच्च गुणवत्ता शाही सेना, पृथक शाही सेना और डीएनए संकरण का प्रवर्धन के अलगाव की आवश्यकता है. इस अनुच्छेद में हम मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक से 2 प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माइक्रोएरे प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन . हम है Agilent 2100 Bioanalyzer "प्रयोगशाला पर एक चिप प्रौद्योगिकी" के साथ पृथक आरएनए नमूनों की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण प्रदर्शन से शुरू होगा. उच्च गुणवत्ता आरएनए नमूने किसी भी माइक्रोएरे प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं, और 2100 Bioanalyzer एक त्वरित नमूना गुणवत्ता के मात्रात्मक माप प्रदान करता है. आरएनए नमूने तो प्रवर्धित और रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन सीडीएनए प्राप्त करके लेबल, लेबल nucleotides क्रेना लेबल उत्पादन की उपस्थिति में इन विट्रो प्रतिलेखन में द्वारा पीछा किया. एक दोहरी रंग लेबलिंग किट का उपयोग करके, हम Cy3 और Cy5 के साथ एक संदर्भ नमूना के साथ हमारी प्रयोगात्मक नमूना लेबल होगा. दोनों नमूने तो और संयुक्त जाएगा Agilent है 4x44 कश्मीर arrays के लिए संकरित. दोहरी रंग arrays दो शाही सेना के नमूनों के बीच एक सीधी तुलना के लाभ की पेशकश, जिससे मापन की सटीकता बढ़ रही है, अभिव्यक्ति के स्तर में छोटे परिवर्तन के लिए विशेष रूप से, क्योंकि दो आरएनए नमूने competitively एक एकल माइक्रोएरे संकरित हैं. arrays दो इसी तरंगदैर्य पर स्कैन किया जाएगा, और प्रत्येक सुविधा के लिए Cy3 Cy5 संकेत के अनुपात इसी mRNA की रिश्तेदार बहुतायत के एक प्रत्यक्ष माप के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. यह विश्लेषण जीन है कि विभिन्न प्रयोगात्मक परीक्षण किया जा रहा शर्तों के जवाब में व्यक्त कर रहे हैं को दिखाता है.
Protocol
1. 2100 Bioanalyzer के साथ शाही सेना के नमूने की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण
इससे पहले कि आप शुरू,
- सीढ़ी और 70 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए अपने नमूनों denature. बर्फ पर तुरंत शांत रहो.
- साफ RNaseZAP साथ 1 मिनट के लिए साधन इलेक्ट्रोड, 10 सेकंड के लिए RNase मुक्त पानी के द्वारा पीछा किया. हवा शुष्क इलेक्ट्रोड की अनुमति दें.
- एक किट के साथ प्रदान की स्पिन फिल्टर में जेल मैट्रिक्स के 550 μl pipeting द्वारा जेल मैट्रिक्स तैयार करें. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए +१५०० आरसीएफ अपकेंद्रित्र. विभाज्य 65 μl aliquots और 4 बजे दुकान ° सी में जेल फ़िल्टर करने के लिए 1 महीने के लिए लिए.
- चिप भड़काना स्टेशन तैयार करने के लिए,
- क्लिप के माध्यम से और luer ताला एडाप्टर में 1 मिलीलीटर सिरिंज डालें.
- बेस प्लेट को समायोजित करने के लिए आधार के तहत पेंच ढीला, प्लेट उठाने और पेंच retightening सी स्थिति है.
- शीर्ष स्थान के लिए सिरिंज क्लिप समायोजित करें.
- कमरे के तापमान पर डाई ध्यान केंद्रित संतुलित. 10 सेकंड के लिए भंवर. फ़िल्टर्ड जेल की एक 65 μl विभाज्य डाई की एक μl जोड़ें. अच्छी तरह से भंवर और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 13,000 आरसीएफ अपकेंद्रित्र. एक दिन के भीतर का उपयोग करें.
जब आप अपने नमूने को चलाने के लिए तैयार हैं - भड़काना स्टेशन पर एक चिप स्थिति. इस प्रोटोकॉल में हम शाही सेना, 6000 नैनो के चिप्स का उपयोग कर रहे हैं. जेल लोड,
- 9 μl पिपेट जेल डाई मिश्रण में अच्छी तरह से एक काले रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ एक सफेद "जी" के साथ चिह्नित की. सुनिश्चित करें कि आपके टिप बहुत अच्छी तरह से नीचे पर तैनात है.
- 1 मिलीलीटर सिरिंज सवार स्थिति. भड़काना स्टेशन बंद. यकीन है कि इसे क्लिक करें ताले.
- सवार प्रेस नीचे धीरे धीरे लेकिन लगातार जब तक यह क्लिप के द्वारा आयोजित किया जाता है.
- 30 सेकंड के लिए रुको. क्लिप रिलीज.
- चलो सवार से ही ऊपर जाना. के बाद यह चलती रुक जाता है है, कुछ सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें और सवार 1 मिलीलीटर स्थिति को वापस खींच. भड़काना स्टेशन खोलें.
- 9 μl पिपेट 2 "जी" को चिह्नित कुओं में से प्रत्येक में जेल डाई मिश्रण की.
- 12 नमूना कुओं में से प्रत्येक में और अच्छी तरह से सीढ़ी में मार्कर के पिपेट 5 μl.
- पिपेट सीढ़ी में तैयार सीढ़ी की एक अच्छी तरह से μl.
- पिपेट नमूना कुओं में 1 प्रत्येक नमूने के μl.
- पिपेट एक μl अच्छी तरह से प्रत्येक अप्रयुक्त नमूना में मार्कर के.
- 2400 rpm पर 1 मिनट के लिए चिप भंवर.
- चिप चलाने,
- 2100 विशेषज्ञ सॉफ्टवेयर प्रारंभ.
- चिप स्थिति और ढक्कन बंद करें. यदि साधन लाइन पर है, एक आइकन दिखाएगा चाहे ढक्कन खुला है या बंद कर दिया और क्या चिप के प्रकार डाला जाता है. सुनिश्चित करें कि सही बंदरगाह चयनित है.
- भागो नमूने लोड हो रहा है वाष्पीकरण को रोकने के के 5 मिनट के भीतर परख.
2. प्रवर्धन और लेबलिंग
माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए, शाही सेना के नमूने प्रवर्धित कर रहे हैं और लेबल, आमतौर पर एक T7 शाही सेना पोलीमरेज़ 3 पर आधारित प्रतिक्रिया में. डबल सीडीएनए फंसे रिवर्स प्रतिलेखन द्वारा उत्पन्न. इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में एक में सीडीएनए प्रयोग किया जाता है उत्पन्न करने के लिए क्या क्रेना के रूप में जाना जाता है. यह प्रतिक्रिया लेबल ribonucleotides की उपस्थिति में किया जाता है, सरणी शाही सेना संकरण के लिए लेबल के माइक्रोग्राम मात्रा में उत्पादन. प्रवर्धन / लेबलिंग तरीकों का चुनाव बाद में माइक्रोएरे के लिए इस्तेमाल किया जा मंच पर निर्भर करता है. इस खंड में, हम है Agilent त्वरित Amp लेबलिंग किट का उपयोग fluorescently लेबल शाही सेना की पीढ़ी का वर्णन.
- पिपेट एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में शाही सेना के 5 μg 50 एनजी. मात्रा 8.3 μl अधिक नहीं होनी चाहिए. यदि आवश्यक हो, या शराब के साथ वैक्यूम centrifugation वर्षण द्वारा अपने आरएनए नमूना ध्यान केंद्रित.
- T7 प्राइमर के 1.2 μl जोड़ें.
- RNase मुक्त पानी के साथ 11.5 μl की अंतिम मात्रा को ले आओ.
- 65 में सेते डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए शाही सेना denature. हम ट्यूब के शीर्ष में संक्षेपण को रोकने के लिए एक गर्म ढक्कन के साथ एक thermocycler का उपयोग की सलाह देते हैं.
- 10 मिनट ऊष्मायन, गर्म 5X पहले Strand बफर के दौरान 80 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए. भंवर और नीचे स्पिन. आरटी पर रखें जब तक का उपयोग करने के लिए तैयार है.
- 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, जल्दी बर्फ पर विकृत आरएनए नमूने के नीचे शांत.
- सीडीएनए मास्टर मिश्रण तैयार करें. प्रतिक्रिया प्रति, निम्नलिखित जोड़ें:
- 4 μl 5X पहले Strand बफर
- 2 μl 0.1 एम डीटीटी
- 1 μl 10 मिमी dNTPs
- 1 μl MMLV - आरटी एंजाइम
- 0.5 μl RNase बाहर.
- द्वारा inverting ट्यूब 4 बार घटकों का मिश्रण. भंवर नहीं करो. नीचे स्पिन ट्यूब के नीचे सामग्री एकत्र.
- नमूना प्रति मास्टर मिश्रण के 8.5 μl जोड़ें. ऊपर और नीचे pipeting मिक्स.
- 2 घंटा 40 में के लिए सेते डिग्री सेल्सियस, 65 में 10 मिनट के द्वारा पीछा डिग्री सेल्सियस हम एक गर्म ढक्कन के साथ एक thermocycler का उपयोग की सलाह देते हैं.
- 5 मिनट के लिए बर्फ के लिए ट्यूबों स्थानांतरण.
- प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण तैयार है. प्रतिक्रिया प्रति, निम्नलिखित जोड़ें:
- 15.3 μl nuclease मुक्त पानी
- 20 μl4X प्रतिलेखन बफर
- 6 μl 0.1 एम डीटीटी
- 8 μl NTPs
- 6.4 μl 50% खूंटी (खूंटी को 40 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed होना चाहिए और resuspension सुनिश्चित vortexed)
- 0.5 μl आउट RNase
- 0.6 μl अकार्बनिक pyrophosphatase
- 0.8 μl T7 शाही सेना पोलीमरेज़
- 2.4 μl Cy3 या Cy5 CTP
- संक्षेप नमूने ट्यूब के तल पर सामग्री इकट्ठा करने के लिए स्पिन.
- नमूना प्रति ट्रांसक्रिप्शन मास्टर मिक्स के 60 μl जोड़ें.
- 2 घंटा के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- RNase मुफ्त पानी के 20 μl जोड़ें.
- लेबल क्रेना शुद्ध अनिगमित nucleotides निकालना. हम Qiagen RNeasy मिनी स्तंभों का उपयोग की सलाह देते हैं.
- लेबल क्रेना यों. हम माइक्रोएरे मापन मोड में एक NanoDrop2000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग की सलाह देते हैं. सुनिश्चित करें कि आप नमूना प्रकार के रूप में शाही सेना-40 का चयन करें.
- रिकॉर्ड नमूना एकाग्रता, उपज (मात्रा से गुणा एकाग्रता के रूप में गणना) और विशिष्ट गतिविधि (1000 क्रेना एकाग्रता पर डाई एकाग्रता के राशन से गुणा के रूप में गणना). माइक्रोएरे संकरण के लिए, यह कम से कम 825 एनजी और कम से कम 8 pmol / μg के एक विशिष्ट गतिविधि की एक उपज प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
3. माइक्रोएरे संकरण
- 65 में संकरण स्टेशन और सेट पर मुड़ें ° सी 2 कम से कम घंटे पहले संकरण शुरू होता है.
- संकरण नमूना तैयार करने के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में निम्नलिखित मिश्रण:
- 825 Cy3 क्रेना एनजी (यह आमतौर पर अपने "इलाज" नमूना है)
- 825 Cy5 क्रेना एनजी (यह आमतौर पर अपने "संदर्भ" नमूना है)
- 11 μl 10X अवरुद्ध एजेंट.
- 52.8 μl के अंतिम मात्रा RNase मुफ्त पानी जोड़ें
- 2.2 μl विखंडन बफर जोड़ें.
- गति कम भंवर मिश्रण है.
- पर 60 ° वास्तव में 30 मिनट के लिए सी सेते हैं. यह क्रेना विखंडन कदम है, जो सरणी संकरण के लिए लेबल टुकड़े उत्पन्न है. यह बहुत महत्वपूर्ण है बिल्कुल के रूप में वर्णित सेते हैं. हम एक गर्म ढक्कन के साथ एक thermocycler के उपयोग की सलाह देते हैं. यह बहुत महत्वपूर्ण है सेते हैं बिल्कुल के रूप में सही औसत लंबाई की जांच उत्पन्न करने के लिए वर्णित है. अत्यधिक या अपर्याप्त विखंडन झूठी नकारात्मक या झूठी सकारात्मक परिणाम होगा.
- विखंडन रोक 2X संकरण बफर के 55 μl जोड़ें. Pipetting, विशेष ख्याल रख रही बुलबुले परिचय नहीं मिलाई.
- अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे सामग्री इकट्ठा. यदि बुलबुले मनाया जाता है, अब उन्हें हटाने के लिए अपकेंद्रित्र.
- बर्फ पर ट्यूब, प्रकाश से सुरक्षित रखें. सरणी पर नमूना के रूप में संभव के रूप में में जल्द ही लोड.
- सरणी लोड करने के लिए, पहले संकरण कक्ष तैयार है. इस प्रोटोकॉल संकरण Roche NimbleGen प्रणाली और A4 मिक्सर कक्षों के साथ है Agilent 4x44K arrays के उपयोग का वर्णन करता है.
- विधानसभा / disassembly के उपकरण, बारकोड पक्ष में एक माइक्रोएरे स्लाइड पहले रखें.
- एक A4 मिक्सर खोलें और चिपकने वाला बेनकाब. सरणी और विधानसभा / disassembly के लिए किसी भी आंदोलन को रोकने के उपकरण होल्डिंग, स्लाइड पर A4 मिश्रक जगह है, दूर के अंत में शुरू. यकीन है कि इसे सही ढंग से उपकरण के लिए गठबंधन किया है. सरणी स्लाइड के साथ सभी मिक्सर रहो.
- मिक्सर के अंत से खींचो स्लाइड / मिक्सर विधानसभा हटाने.
- Braying उपकरण का उपयोग करना, चिपकने वाला गैसकेट सब साथ प्रेस करने के लिए यकीन है कि यह कसकर theslide करने के लिए सरेस से जोड़ा हुआ है. लघु हवा चिपकने वाला और स्लाइड के बीच फंस बुलबुले को एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ देखा जा सकता है. Braying उपकरण के साथ इन बुलबुले को हटाने के लिए अतिरिक्त समय ले लो. आपका सरणी अब लोड किया जा के लिए तैयार है.
- एक सकारात्मक विस्थापन विंदुक प्रयोग संकरण नमूना के 100 μl लोड. बंदरगाह छेद के अंदर कसकर टिप पुश, फिर धीरे से और आसानी बग़ैर कि हवा सरणी क्षेत्र में नहीं फंस गया है. कभी नमूना वापस ऊपर चूसना की कोशिश करो. एक बार पूरे नमूना तिरस्कृत किया गया है, बिना बंदरगाह छेद पर टिप सवार जारी रखो. जब नमूना पूरी सरणी शामिल हैं और तरल बाहर वेंट बंदरगाह आने शुरू होता है, जल्दी विंदुक हटा दें. केवल सवार रिलीज एक बार टिप स्लाइड से दूर है.
- धीरे थपका दोनों बंदरगाहों पर अतिरिक्त तरल. सुनिश्चित करें कि आप नमूना चैम्बर में ही आकर्षित नहीं करते बाहर.
- चिमटी का उपयोग करके स्टिकर के साथ बंदरगाह छेद कवर.
- संकरण स्टेशन पर स्लाइड रखो, और जाँच करें कि मूत्राशय छेद सही ढंग से O-अंगूठी पर तैनात हैं. यह उचित सुनिश्चित करें संकरण के दौरान मिश्रण होगा.
- स्लाइड को कवर किया और स्टेशन ढक्कन बंद करें. मिश्रण मोड बी करने के लिए स्टेशन सेट
- 65 में सरणी संकरण डिग्री सेल्सियस 17 घंटे के लिए.
- 0.005% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए X-102 ट्राइटन जोड़कर तैयार धो बफर 2. 37 डिग्री सेल्सियस रात भर रखें.
4. माइक्रोएरे धोने
- के लिए 0.005% की एक अंतिम एकाग्रता को धो बफर 1 X-102 ट्राइटन जोड़ें. कमरे temperatur पर रखेंई.
- जब संकरण समाप्त हो गया है, एक गिलास पकवान धो एक बफर के साथ "ए" भरें. डिश विधानसभा / disassembly के उपकरण पकड़ और कुछ maneuvering के रूप में अच्छी तरह से की अनुमति काफी बड़ा होना चाहिए. कांच के बने पदार्थ सभी washes में किया जाना चाहिए. प्लास्टिक के बर्तन से बचें, क्योंकि वे नमकीन पानी यौगिकों सरणी में उच्च पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप के लिए करते हैं.
- एक स्लाइड और एक धुंधला डिश 'बी' में हलचल बार रैक रखो. धो एक बफर के साथ भरें, यकीन है कि यह रैक को शामिल किया गया. कमरे के तापमान पर एक हलचल प्लेट पर रखें.
- एक खाली धुंधला पकवान "सी" एक हलचल थाली पर और जगह पर एक हलचल बार रखो.
- सरणी से निकालें और यह विधानसभा / disassembly उपकरण में डाल दिया. पकवान 'ए' में पूरे विधानसभा डूब.
- जबकि विपरीत दिशा से सावधानी A4 मिक्सर बंद छील उपकरण विधानसभा / disassembly और स्लाइड एक हाथ से पकड़े,. यकीन है कि आप सरणी क्षेत्र खरोंच नहीं.
- जल्दी स्लाइड जगह पकवान "बी" धुंधला में रैक में है. अब से, हवा के संपर्क के बाद से Cy5 डाई ओजोन के प्रति संवेदनशील है कम से कम किया जाना चाहिए. एक समय में अधिक से अधिक 8 सरणियों धो मत करो.
- मध्यम गति से 1 मिनट आलोड़न के लिए धोएं.
- पकवान पूर्व गर्म धो बफर 2 के साथ धुंधला हो जाना "सी" भरें. स्लाइड्स स्थानांतरण और 1 मिनट के लिए धो.
- बहुत धीरे धीरे पकवान "सी" धुंधला हो जाना करने के लिए स्लाइड पर पीछे छोड़ दिया बूंदों को कम से स्लाइड रैक हटा दें.
- 2 मिनट के लिए कताई द्वारा स्लाइड सूखी. यदि कोई संगत अपकेंद्रित्र उपलब्ध नहीं है, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्लाइड अपकेंद्रित्र या इसे खत्म आर्गन गैस उड़ा.
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जगह स्लाइड और आर्गन गैस के साथ भरने. तुरंत स्कैन संकेत हानि से बचने के. हम आण्विक उपकरण से GenePix 4000B स्कैनर के उपयोग की सलाह देते हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
अच्छी गुणवत्ता कुल शाही सेना के नमूने केवल दो प्रमुख चोटियों का उत्पादन जब गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक Bioanalyzer में चलाने के लिए, 2 प्रमुख ribosomal शाही सेना प्रजातियों के लिए इसी चाहिए. कुछ आरएनए गिरावट पहली ribosomal शाही सेना चोटी से पहले एक धब्बा के रूप में दिखाई देगा. गंभीर रूप से अपमानित, कम गुणवत्ता शाही सेना एक व्यापक चोटी या कम प्रतिधारण समय चोटियों की एक श्रृंखला दिखाने के लिए, जबकि 2 ribosomal शाही सेना चोटियों बहुत कम तीव्रता या सभी में पहचाना नहीं जाएगा. 2100 Bioanalyzer उत्पादन के उदाहरण के लिए, 1 आंकड़ा देखें.
विशेषज्ञ 2100 सॉफ्टवेयर शाही सेना गुणवत्ता का एक मात्रात्मक माप के रूप में एक शाही सेना वफ़ादारी संख्या, या RIN की गणना करेगा. RIN 9 से उच्च मूल्यों के साथ उच्च गुणवत्ता के नमूने, जाहिर है सबसे अच्छा कर रहे हैं अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोएरे. हालांकि, हम RIN के रूप में उचित गुणवत्ता के माइक्रोएरे डेटा पैदा में 5.2 के रूप में कम मूल्यों के साथ नमूने का इस्तेमाल किया है.
अच्छी गुणवत्ता arrays अपेक्षाकृत कम PMT मूल्यों पर उच्च संकेत उत्पादन चाहिए. हमारे प्रयोग में टेप के सबसे प्रयोगात्मक और संदर्भ नमूना में समान स्तर पर मौजूद हो की उम्मीद कर रहे हैं, जीन अभिव्यक्ति में बड़े पैमाने पर, व्यापक परिवर्तन शायद किसी भी जैविक महत्व की कमी होगी. इसलिए, सरणी के ज्यादातर बजाय हरे या लाल पीले दिखना चाहिए. अच्छी गुणवत्ता का संकेत भी ऐसी है कि संकेत histograms पूरी तरह से ओवरलैप एक गतिशील रेंज में किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, 2 आंकड़ा देखें.
चित्रा 1 शाही सेना के चार मानव मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक से अलग नमूने का उदाहरण है . शाही सेना 3.1.1 में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कर पृथक किया गया. नमूना गुणवत्ता एक शाही सेना 6000 के रूप में 3.1.3 में वर्णित चिप पर 2100 Bioanalyzer उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. नमूने 4 अलग शाही सेना गुण के प्रतिनिधि हैं: एक, बहुत अच्छा शाही सेना (9> RIN) गुणवत्ता, बी, आंशिक रूप से अपमानित (5-6 RIN 28S rRNA के लिए काफी कम चोटी नोट) शाही सेना, सी, अत्यधिक अपमानित शाही सेना (RIN < 3), डी, लगभग पूरी तरह से अपमानित शाही सेना (RIN = 2). हम करने के लिए इसी तरह की या बी (RIN> 5.2) की तुलना में बेहतर बहाव माइक्रोएरे अनुप्रयोगों के लिए गुणों के साथ सफलतापूर्वक नमूनों का इस्तेमाल किया. ठोस और खुले arrowheads को 18s और 28S rRNA प्रजातियों की स्थिति, क्रमशः संकेत मिलता है.
चित्रा 2 सरणी छवियों और स्कैटर भूखंडों के उदाहरण.. ए, पूरे स्लाइड का पूर्वावलोकन, चार arrays 4X44K Agilent के प्रारूप में दिखा, बी, एक सरणी क्षेत्रों के के उच्च संकल्प स्कैन, ध्यान दें कि संकेतों के न तो (लाल या हरे रंग) प्रमुख है, सी, छवि के तितर बितर में प्लॉट बी, कृपया ध्यान दें कि संकेत पूरी तरह से ओवरलैप और कोई 1x10 की तुलना में अधिक -6 सुविधाओं saturating तीव्रता में हैं.
Discussion
डीएनए के साथ अभिव्यक्ति की रूपरेखा दो जैविक नमूनों के बीच विभिन्न व्यक्त जीनों की पहचान के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करता है. सफल अभिव्यक्ति की रूपरेखा प्रयोगों उच्च गुणवत्ता आरएनए नमूने, मजबूत लेबलिंग और संकरण की आवश्यकता है. हमारे अनुभव में, वाणिज्यिक और arrays Agilent से लेबलिंग किट एक उचित कीमत पर उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्रदान करते हैं. जबकि Agilent भी अपने स्वयं के संकरण और स्कैनिंग मशीनरी प्रदान करता है, हम Roche NimbleGen और आण्विक उपकरण से GenePix 4000B माइक्रोएरे स्कैनर से संकरण प्रणाली एहसान. ध्यान दें कि संकरण Roche NimbleGen इकाई के पूर्व माउ संकरण प्रणाली के रूप में जाना जाता था. Roche द्वारा हाल ही में कॉर्पोरेट अधिग्रहण के बाद, A4 mixers बंद कर दिया गया है. इस लेखन के समय के रूप में, वे अभी भी Kreatech निदान (जैसे अन्य विक्रेताओं के माध्यम से पाया जा सकता है www.kreatech.com, इस वेबसाइट को भी एक सुविधाजनक सरणी संगतता उपकरण प्रदान करता है), लेकिन लंबी अवधि के स्टॉक की उपलब्धता अनिश्चित है. अन्य संकरण सिस्टम उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, Agilent से), तथापि, अगर संगत mixers के लिए सरणी इस्तेमाल किया जा रहा पाया जा सकता है, हम अपनी गुणवत्ता और reproducibility के लिए है Roche NimbleGen प्रणाली की सिफारिश.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के जेम्स एस McDonnell फाउंडेशन 21 वीं सदी पुरस्कार कार्यक्रम से प्रवर्तन निदेशालय को अनुदान, और एक NIH निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था. गपशप में भाग पुनर्योजी चिकित्सा के कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
| 2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
| Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
| Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
| Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
| Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
| A4 mixer hybridization chambers | |||
| Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
| Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
| Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
| Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
| Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
| GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
References
- Diaz, E. One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease. Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).
- Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).
- Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).
