Summary
Vi visar användningen av DNA microarrays för expression profiling av nervsystemet. Vi beskriver RNA kvalitetskontroll, prov märkning och array hybridisering och skanning.
Abstract
Microarray expression profiling av nervsystemet ger en kraftfull metod för att identifiera gener verksamhet i olika stadier av utveckling, olika fysiologiska eller patologiska tillstånd, svar på behandling och i allmänhet alla tillstånd som håller på att experimentellt testas 1. Expression profiling av neurala vävnader kräver isolering av hög kvalitet RNA, amplifiering av isolerade RNA och hybridisering av DNA microarrays. I denna artikel beskriver vi protokoll för reproducerbara microarray experiment från hjärnan tumörvävnad 2. Vi börjar med att utföra en analys kvalitetskontroll av isolerade RNA-prover med Agilents 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip"-teknik. Hög kvalitet RNA-prover är avgörande för framgången för någon microarray experiment, och 2100 Bioanalyzer ger en snabb, kvantitativ mätning av provets kvalitet. RNA-prover sedan förstärks och märks genom att utföra omvänd transkription för att få cDNA, följt av in vitro transkription i närvaro av märkta nukleotider för att producera märkt Crna. Genom att använda en tvåfärgad märkning kit, kommer vi att märka våra experimentella provet med Cy3 och ett referensprov med Cy5. Båda proven kommer sedan att kombineras och hybridiseras till Agilents 4x44 K matriser. Dual-färg arrayer har fördelen att en direkt jämförelse mellan två RNA-prover, vilket ökar noggrannheten i mätningarna, särskilt för små förändringar i uttryck nivåer, eftersom de två RNA-proverna hybridiseras konkurrenskraftigt till en enda microarray. Den arrayer kommer att skannas i två motsvarande våglängder, och förhållandet mellan Cy3 att Cy5 signal för varje funktion kommer att användas som en direkt mätning av den relativa förekomsten av motsvarande mRNA. Denna analys identifierar gener som differentiellt uttrycks som svar på den experimentella förhållanden som testas.
Protocol
1. Kvalitetskontroll analys av RNA provet med 2100 Bioanalyzer
Innan du börjar,
- Denaturera stegen och dina prover vid 70 ° C i 10 min. Chill på kylning omedelbart.
- Rengör instrumentet elektroder med RNaseZAP i 1 min, följt av RNas-fritt vatten i 10 sek. Låt elektroderna lufttorka.
- Förbered gelmatrisen av pipeting 550 ìl av gelmatrisen till en spin-filter som medföljer satsen. Centrifugera vid 1500 RCF i 10 min i rumstemperatur. Alikvotera den filtrerade gelen i 65 l alikvoter och förvara vid 4 ° C upp till 1 månad.
- För att förbereda chipet grundning stationen,
- Sätt en 1-ml spruta genom klämman och in i Luer Lock-adapter.
- Justera bottenplattan till läge C genom att lossa skruven under det grundläggande, att lyfta plattan och dra åt skruven.
- Ställ sprutan klippet till toppositionen.
- Jämvikt färgen koncentrera till rumstemperatur. Vortexa i 10 sek. Tillsätt 1 l av färg till ett 65 l alikvot av filtrerad gel. Vortex väl och centrifugera vid 13 tusen RCF i 10 min i rumstemperatur. Använd inom en dag.
När du är redo att köra dina prover, - Placera en marker på grundningen stationen. I detta protokoll använder vi RNA 6000 nano marker. För att ladda gelen,
- Pipettera över 9 ìl av gel-dye blanda i de markerade bra med ett vitt "G" mot en svart bakgrund. Se till att ditt tips är placerad längst ner i brunnen.
- Placera kolven på 1 ml. Stäng grundning station. Se till att det klick-lås.
- Tryck ned kolven sakta men säkert tills det innehas av klippet.
- Vänta 30 sek. Släpp klämman.
- Låt kolven går upp av sig själv. Efter det stannar, vänta några sekunder och dra tillbaka kolven till 1 ml position. Öppna grundning stationen.
- Pipettera över 9 ìl av gel-dye mix i de två brunnarna märkt "G".
- Pipettera 5 ìl av markör i varje 12 provbrunnar och i stegen också.
- Pipettera 1 l av det beredda stege på stege väl.
- Pipettera 1 ìl av varje prov i provbrunnar.
- Pipettera 1 ìl av märktråd i alla oanvända prov väl.
- Vortexa chip för 1 min vid 2400 rpm.
- För att köra chip,
- Starta 2100 Expert Software.
- Placera chip och stäng locket. Om instrumentet är on-line, kommer en ikon visar om luckan är öppen eller stängd och vilken typ av chip sätts in. Kontrollera att rätt port är vald.
- Kör analysen inom 5 minuter av lastning proverna för att förhindra avdunstning.
2. Förstärkning och märkning
För att förbereda microarray analys, är RNA-prover förstärks och märks oftast i en reaktion på T7 RNA-polymeras 3. Dubbel strandsatta cDNA genereras genom omvänd transkription. cDNA används i en in vitro transkription reaktion för att skapa vad som kallas Crna. Denna reaktion sker i närvaro av märkt ribonucleotides, som producerar mikrogram mängder märkt RNA för array hybridisering. Valet av förstärkning / märkningssystem som beror på den efterföljande microarray-plattform som ska användas. I detta avsnitt beskriver vi generationen av fluorescerande RNA med hjälp av Agilents Quick kit Amp märkning.
- Pipettera 50 ng till 5 mikrogram av RNA i ett 1,5 ml rör. Volymen bör inte överstiga 8,3 l. Om det behövs, koncentrera er RNA-prov av vakuum centrifugering eller fällning med alkohol.
- Tillsätt 1,2 l av T7 primer.
- Ta till en slutlig volym på 11,5 l med RNase-fritt vatten.
- Inkubera vid 65 ° C i 10 min att denaturera RNA. Vi rekommenderar att du använder en termocykler med en varm lock för att förhindra kondens i toppen av röret.
- Under 10 minuter inkubation, varm 5X First Strand buffert till 80 ° C i 5 min. Vortex och spinn ner. Förvara vid RT tills den ska användas.
- Efter 10 minuter inkubation, snabbt kyla ner det denaturerade RNA-proverna på is.
- Förbered cDNA Master Mix. Per reaktion, lägg till följande:
- 4 l 5X First Strand buffert
- 2 l 0,1 M DTT
- 1 l 10 mM dNTPs
- 1 l MMLV-RT enzymet
- 0,5 l RNas Out.
- Blanda komponenterna genom att vända röret 4 gånger. Inte virvel. Spinn ner för att samla innehållet i botten av röret.
- Tillsätt 8,5 l av Master Mix per prov. Blanda genom pipeting upp och ner.
- Inkubera i 2 tim vid 40 ° C, följt av 10 minuter vid 65 ° C. Vi rekommenderar att du använder en termocykler med en uppvärmd lock.
- Överför rören till is i 5 min.
- Förbered blandningen transkription master. Per reaktion, lägg till följande:
- 15,3 l nukleasfritt vatten
- 20 l4X transkription buffert
- 6 l 0,1 M DTT
- 8 l NTPs
- 6,4 l 50% PEG (PEG bör vara uppvärmd till 40 ° C och vortexed att säkerställa resuspension)
- 0,5 l RNas Out
- 0,6 l oorganiskt pyrophosphatase
- 0,8 l T7 RNA-polymeras
- 2,4 l Cy3-eller Cy5 CTP
- Kortfattat snurra prover för att samla innehållet i botten av röret.
- Tillsätt 60 ìl Transkription Master Mix per prov.
- Inkubera vid 40 ° C i 2 tim.
- Tillsätt 20 l RNase-fritt vatten.
- Rena märkt Crna att ta bort unincorporated nukleotider. Vi rekommenderar Qiagens RNeasy mini kolumner.
- Kvantifiera märkt Crna. Vi rekommenderar att du använder en NanoDrop2000 spektrofotometer i Microarray mätningsläget. Se till att du väljer RNA-40 som provtyp.
- Spela in prov koncentration, avkastning (beräknat som koncentration multiplicerat med volym) och specifik aktivitet (beräknat som 1000 multiplicerat med ranson av färgen koncentrationen Crna koncentration). För microarray hybridisering är det nödvändigt att uppnå en avkastning på minst 825 ng samt en särskild verksamhet på minst 8 pmol / mikrogram.
3. Microarray hybridisering
- Slå på hybridisering stationen och inställd på 65 ° C i minst 2 timmar före hybridisering börjar.
- För att förbereda hybridisering provet, blanda följande i ett 1,5 ml rör:
- 825 ng Cy3-Crna (detta är oftast din "behandlad" prov)
- 825 ng Cy5-Crna (detta är vanligtvis din "referens" prov)
- 11 l 10X blockerande medel.
- Lägg RNas-fria vatten till en slutlig volym på 52,8 l
- Tillsätt 2,2 l fragmentering buffert.
- Vortex vid låg hastighet för att blanda.
- Inkubera vid 60 ° C i exakt 30 min. Detta är den Crna fragmentering steget, vilket genererar märkt fragment för array hybridisering. Det är mycket viktigt att inkubera exakt enligt beskrivningen. Vi rekommenderar användning av en termocykler med en uppvärmd lock. Det är mycket viktigt att inkubera exakt enligt beskrivningen att generera sonder av rätt medellängd. Överdriven eller otillräcklig fragmentering kommer att resultera i falska negativa och falska positiva.
- Tillsätt 55 ìl 2X Hybridisering buffert för att stoppa fragmentering. Blanda genom att pipettera, med särskild omsorg att inte införa bubblor.
- Centrifugera i 1 min vid maximal hastighet för att samla innehållet i botten av röret. Om bubblor observeras, centrifugera längre tid att ta bort dem.
- Placera röret på is, skyddas från ljus. Ladda provet på matrisen så snart som möjligt.
- För att ladda arrayen, först förbereda hybridisering kammaren. Detta protokoll beskriver användningen av Agilents 4x44K matriser med Roche-Nimblegen hybridisering systemet och A4 kammare mixer.
- Placera en microarray bild i montering / demontering verktyg, streckkod sidan först.
- Öppna ett A4-mixer och exponera lim. Håll matris och montering / demontering verktyg för att förhindra rörelse, placera A4 blandaren på bilden, med början längst. Se till att den är rätt anpassad till verktyget. Stick mixern längs arrayen bilden.
- Dra från slutet av mixern för att ta bort bilden / mixer montering.
- Med hjälp av skriande verktyg trycker längs självhäftande packningen för att se till att det är tätt klistrad theslide. Små luftbubblor fastnar mellan limmet och den bilden kan ses mot en mörk bakgrund. Ta extra tid att ta bort dessa bubblor med de skriande verktyget. Din array är nu redo att laddas.
- Använd en positiv förskjutning pipett för att ladda 100 ìl av hybridisering provet. Skjut spetsen tätt innanför porten hålet, sedan dosera långsamt och i jämn så att luften inte är instängd i arrayen området. Försök aldrig att suga provet igen. När hela provet har doseras, hålla spetsen på babords hål utan att släppa kolven. När provet täcker hela arrayen och vätskan börjar komma ut ventilen hamnen, snabbt ta bort pipetten. Endast Släpp kolven när spetsen är borta från bilden.
- Försiktigt badda överflödig vätska i båda hamnarna. Se till att du inte drar prov ut ur kammaren själv.
- Täck hamnen hålen med klistermärken med hjälp av pincett.
- Sätt bilden på hybridisering stationen, och kontrollera att blåsan hålen är rätt placerad över O-ringarna. Detta kommer att säkerställa korrekt blandning under hybridisering.
- Stäng skjut locket och stationen locket. Ställ in stationen för att blanda läge B.
- Hybridisera arrayen vid 65 ° C i 17 timmar.
- Förbered tvättbuffert 2 genom att lägga till Triton X-102 till en slutlig koncentration av 0,005%. Förvara vid 37 ° C över natten.
4. Microarray tvätt
- Lägg Triton X-102 till tvättbuffert 1 till en slutlig koncentration av 0,005%. Förvara i rumstemperatur Temperature.
- När hybridisering är klar, fylla en glasskål "A" med tvättbuffert 1. Skålen ska vara stora nog att rymma montering / demontering verktyget och möjliggör vissa manövrering också. Alla tvättar bör ske i glas. Undvik plastskålar eftersom de tenderar att läcka föreningar resulterar i en hög bakgrund i arrayen.
- Sätt en bild rack och en omrörare i en färgning maträtt "B". Fyll med Tvättbuffert 1, se till att det täcker racket. Placera på en uppståndelse plattan vid rumstemperatur.
- Sätt en omrörare på en tom färgning maträtt "C" och placera den på ett rör tallrik.
- Ta bort matris och placera den i montering / demontering verktyg. Sänk ner hela församlingen i skålen "A".
- Håll montering / demontering verktyget och skjut från motsatta sidor med en hand, försiktigt bort det A4-mixern. Se till att du inte repar arrayen området.
- Placera snabbt bilden i racket i färgning maträtten "B". Från och med nu bör exponering för luft minimeras eftersom Cy5 färgen är känslig för ozon. Tvätta inte mer än 8 arrayer samtidigt.
- Tvätta i 1 minut under omrörning på medelhög hastighet.
- Fyll färgning maträtt "C" med förvärmda Tvättbuffert 2. Överför objektglasen och tvätta i 1 minut.
- Mycket sakta ut bilden rack från färgning maträtten "C" för att minimera droppar kvar på bilden.
- Torka bild genom att snurra i 2 minuter. Om en kompatibel centrifug inte är tillgänglig, centrifugera bild i en 50 ml E-rör eller blåsa argongas över den.
- Placera objektglasen i ett 50-ml konisk tub och fyll den med argongas. Skanna omedelbart för att undvika signalförlust. Vi rekommenderar användning av GenePix 4000B scannern från Molecular Devices.
5. Representativa resultat:
Bra kvalitet totala RNA-prover bör endast producerar två stora toppar som körs i en Bioanalyzer för kvalitetskontroll, som motsvarar det 2 stora ribosomalt RNA arter. Vissa RNA nedbrytning kommer visas som en smet före första ribosomalt RNA topp. Försämras kraftigt, kommer låg kvalitet RNA visar en bred topp eller en serie av toppar vid låga retentionstider, medan 2 ribosomalt RNA toppar kommer att vara mycket låg intensitet eller inte kan identifieras alls. För exempel på 2100 Bioanalyzer utgång, se figur 1.
Expert 2100 programvara kommer att beräkna en RNA Integrity-nummer, eller RIN, som en kvantitativ mätning av RNA kvalitet. Hög kvalitet prover med RIN värden högre än 9, är uppenbarligen bäst för microarray applikationer. Vi har dock använt prover med RIN värden så låga som 5,2 generera microarray data av rimlig kvalitet.
Bra kvalitet arrayer ska producera hög signal vid relativt låga PMT värden. I vårt experiment, de flesta av avskrifter förväntas finnas på liknande nivåer i de experimentella och referens provet, massiv, omfattande förändringar i genuttryck kommer förmodligen saknar biologisk betydelse. Därför bör de flesta av arrayen ser gula snarare än grönt eller rött. Bra kvalitet signaler bör också i ett dynamiskt omfång så att signalen histogrammen helt överlappar varandra. För exempel, se figur 2.
Figur 1. Exempel på fyra RNA-prover som isolerats från människans hjärna tumörvävnad. RNA var isoleras med hjälp av protokollet som presenteras i 3.1.1. Exempel kvalitet bedömdes med hjälp av 2100 Bioanalyzer på en RNA-6000 chip som beskrivs i 3.1.3. Proven är representativa för 4 olika RNA egenskaper: A, mycket bra RNA kvalitet (RIN> 9), B, delvis försämrat RNA (RIN 5-6, notera betydligt lägre toppen för 28S rRNA), C, mycket försämrad RNA (RIN < 3), D, nästan helt nedbrutna RNA (RIN = 2). Vi har framgångsrikt använt prover med egenskaper liknande eller bättre än B (RIN> 5,2) för nedströms microarray applikationer. Solid och öppna pilspetsar ange positionen för 18S och 28S rRNA arter, respektive.
Figur 2. Exempel på array bilder och tomter scatter. En, hela du i förhandsgranskningen, som visar fyra matriser i 4X44K Agilent format, B, högupplöst skanning av en av arrayen områden, notera att ingen av de signaler (röd eller grön) dominerar, C, punktdiagram av bilden i B, observera att signalerna helt överlappar varandra och inte mer än 1x10 -6 funktioner är på mättar intensitet.
Discussion
Expression profiling med DNA microarrays ger en enkel metod för att identifiera differentiellt uttryckta gener mellan två biologiska prover. Framgångsrika expression profiling experiment kräver hög kvalitet RNA-prover, robusta märkning och hybridisering. Vår erfarenhet är den kommersiella matriser och byggsatser märkning från Agilent ge data av hög kvalitet till en rimlig kostnad. Även Agilent erbjuder också sina egna hybridisering och skanning maskiner för vi hybridisering systemet från Roche-Nimblegen och GenePix 4000B microarray skanner från Molecular Devices. Observera att Roche-Nimblegen hybridisering enhet som tidigare var känd som MAUI hybridisering systemet. Efter den senaste tidens företagsköp av Roche, har A4 blandare avbrutits. Från och med tidpunkten för denna skrift, kan de fortfarande hittas genom andra säljare som Kreatech Diagnostics ( www.kreatech.com ; denna webbplats erbjuder också ett praktiskt verktyg array kompatibilitet), men på lång sikt lagertillgänglighet är osäker. Andra hybridisering system finns tillgängliga (till exempel från Agilent), men om kompatibla blandare finns för matrisen som används, rekommenderar vi Roche-Nimblegen system för dess kvalitet och reproducerbarhet.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag till ED från James S. McDonnell Foundation 21: a århundradet Program, och en NIH direktörens Nya Innovator Award. GAB stöddes delvis av ett postdoktorsstipendium från California Institute of regenerativ medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
| 2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
| Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
| Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
| Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
| Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
| A4 mixer hybridization chambers | |||
| Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
| Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
| Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
| Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
| Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
| GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
References
- Diaz, E. One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease. Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).
- Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).
- Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).
