Summary
Мы демонстрируем использование ДНК-микрочипов для выражения профилирования нервной системы. Мы описываем РНК контроля качества, образец маркировки и гибридизации массива и сканирования.
Abstract
Microarray выражение профилирования нервная система представляет собой мощный подход к выявлению генов деятельности в различных стадиях развития, различных физиологических или патологических состояний, ответ на терапию, и, в общем, любые условия, что в настоящее время экспериментально проверены 1. Выражение профилирования нервной ткани требует изоляции высокого качества РНК, усиление изолированной РНК и гибридизации ДНК-микрочипов. В этой статье мы расскажем протоколов для воспроизводимых экспериментов микрочипов от опухоли головного мозга ткани 2. Мы начнем с анализа выполнения контроля качества изолированных образцов РНК с 2100 компании Agilent Bioanalyzer "лаборатории-на-чипе" технологии. Высокое качество РНК образцы имеют решающее значение для успеха любой эксперимент микрочипов, и 2100 Bioanalyzer обеспечивает быстрый, количественное измерение качества образцов. РНК образцы затем усиливается и маркированы путем проведения обратной транскрипции для получения кДНК, после чего в пробирке транскрипции в присутствии меченых нуклеотидов для получения меченых кРНК. С помощью двойного цвет маркировки комплект, мы обязательно этикетке нашего экспериментального образца с Cy3 и эталонного образца с Cy5. Оба образца затем будут объединены и гибридизации с компании Agilent 4x44 массивы K. Двойной цвет массивы предлагаем преимущество прямого сравнения двух образцов РНК, тем самым повышая точность измерений, в частности для небольших изменений в уровни экспрессии, потому что два РНК образцы конкурентоспособной гибридизированных к одному микрочипов. Массивы будут проверяться на два соответствующих длин волн, и отношение к Cy3 Cy5 сигнала для каждой функции будет использоваться в качестве прямого измерения относительной численности соответствующей мРНК. Этот анализ определяет гены, которые разному экспрессируются в ответ на экспериментальных условиях проходит испытания.
Protocol
1. Контроль качества Анализ образцов РНК с 2100 Bioanalyzer
Прежде чем начать,
- Денатурировать лестнице и ваши образцы при температуре 70 ° С в течение 10 мин. Холод сразу на лед.
- Прибор очистить электроды с RNaseZAP в течение 1 мин, после чего РНКазы без воды в течение 10 сек. Разрешить электродов высохнуть на воздухе.
- Подготовка гель матрицы pipeting 550 мкл геля матрицы в спиновый фильтр снабжен комплектом. Центрифуга на 1500 RCF в течение 10 мин при комнатной температуре. Алиготе фильтруется гель в 65 мкл аликвоты и хранить при температуре 4 ° С до 1 месяца.
- Для подготовки чип станции грунтовка,
- Вставка 1-мл шприцем через клип и в Luer адаптер замка.
- Отрегулируйте основание позиционировать C, ослабив винт под основание, поднимая тарелку и подтяжки винтов.
- Отрегулируйте шприц клип на первое место.
- Равновесия красителя сконцентрироваться до комнатной температуры. Vortex на 10 сек. Добавить 1 мкл красителя 65 мкл фильтруется гель. Vortex хорошо и центрифуге при 13000 RCF в течение 10 мин при комнатной температуре. Использовать в течение одного дня.
Когда вы будете готовы для запуска образцов, - Позиция чип на грунтовки станции. В этом протоколе мы используем РНК нано 6000 фишек. Чтобы загрузить гель,
- Внесите 9 мкл геля краски смешиваются в хорошо заметны с белым "G" на черном фоне. Убедитесь, что ваш конец находится на самом дне ямы.
- Установите поршень шприца на 1 мл. Закрыть грунтовки станции. Убедитесь, что клик-замки.
- Пресс поршень вниз медленно, но неуклонно, пока она удерживается клипа.
- Подождите 30 сек. Релиз клипа.
- Пусть поршень подниматься сама по себе. После того, как перестает двигаться, подождите несколько секунд и потяните поршень обратно в 1 мл позиции. Открытый грунт станции.
- Внесите 9 мкл геля краски смешиваются в каждом из 2 скважины с пометкой "G".
- Внесите 5 мкл маркера в каждом из 12 скважин образца и в лестнице хорошо.
- Внесите 1 мкл подготовленных лестнице в лестничных хорошо.
- Внесите 1 мкл каждого образца в образце скважин.
- Внесите 1 мкл маркера в каждом неиспользованные образцы хорошо.
- Vortex чип в течение 1 мин при 2400 оборотах в минуту.
- Для запуска чипа,
- Начало 2100 Эксперт программного обеспечения.
- Поместите фишку и закройте крышку. Если инструмент он-лайн, значок покажет, сможет ли крышка открыта или закрыта и какой тип чипа установлена. Убедитесь, что выбран правильный порт.
- Выполнить анализ в течение 5 мин загрузки образцов для предотвращения испарения.
2. Усиление и маркировки
Для подготовки к анализу микрочипов, РНК образцы усиливаются и помечены, как правило, в реакции на основе РНК-полимеразы Т7 3. Двухцепочечной кДНК порожден обратной транскрипции. кДНК используется в реакции в пробирке транскрипции для создания так называемой кРНК. Эта реакция проводится в присутствии меченых рибонуклеотидов, производя мкг количества меченой РНК для массива гибридизации. Выбор усиления / маркировки методов зависит от последующих платформы микрочипов, которые будут использоваться. В этом разделе мы опишем поколения флуоресцентно меченных РНК с помощью быстрой маркировки Amp компании Agilent комплект.
- Внесите 50 нг до 5 мкг РНК в 1,5 мл трубки. Объем не должен превышать 8,3 мкл. При необходимости сосредоточить свои образцы РНК центрифугированием вакууме или осадков с алкоголем.
- Добавить 1,2 мкл праймера Т7.
- Довести до конечного объема в 11,5 мкл РНКазы без воды.
- Инкубировать при 65 ° С в течение 10 минут для денатурации РНК. Мы рекомендуем использовать Термоциклер с горячей крышкой для предотвращения образования конденсата в верхней части трубки.
- За 10 мин инкубации, теплый 5X первый буфер Strand до 80 ° С в течение 5 мин. Vortex и спином вниз. Хранить при комнатной температуре до готовности к использованию.
- После 10 мин инкубации, быстро остывают денатурированного образцов РНК на льду.
- Подготовка кДНК Mix Master. Пер реакции, добавьте следующее:
- 4 мкл 5X первый буфер Strand
- 2 мкл 0,1 М ДТТ
- 1 мкл 10 мМ дНТФ
- 1 мкл MMLV-RT фермента
- Из 0,5 мкл РНКазы.
- Смешайте компоненты путем обращения трубки в 4 раза. Не вихря. Спином вниз собрать содержимое на дне трубки.
- Добавить 8,5 мкл мастер смеси на образце. Смешайте по pipeting вверх и вниз.
- Инкубируйте в течение 2 часов при 40 ° С, затем 10 мин при 65 ° C. Мы рекомендуем использовать Термоциклер с подогревом крышкой.
- Передача труб на лед в течение 5 мин.
- Подготовьте смесь транскрипции хозяина. Пер реакции, добавьте следующее:
- 15,3 мкл нуклеазы без воды
- 20 мкл4X буфера транскрипции
- 6 мкл 0,1 М ДТТ
- 8 мкл НПТ
- 6,4 мкл 50% ПЭГ (ПЭГ должны быть предварительно нагретого до 40 ° С и перемешивали для обеспечения ресуспендирования)
- 0,5 мкл РНКазы Out
- 0,6 мкл неорганических пирофосфатазы
- 0,8 мкл Т7 РНК-полимеразы
- 2,4 мкл Cy-3-или Cy5 CTP
- Кратко спина образцы для сбора содержимого в нижней части трубы.
- Добавить 60 мкл Транскрипция Master Mix на образец.
- Инкубировать при 40 ° С в течение 2 часов.
- Добавьте 20 мкл РНКазы без воды.
- Purify помечены кРНК удалить неинкорпорированных нуклеотидов. Мы рекомендуем использовать Qiagen в RNeasy мини-колонны.
- Количественная помечены кРНК. Мы рекомендуем использовать NanoDrop2000 спектрофотометр в режиме измерения Microarray. Убедитесь, что вы выберите РНК-40 в качестве образца типа.
- Запись образец концентрации, доходность (рассчитанная как концентрация умножается на объем) и удельную активность (в расчете на 1000 умножается на рацион концентрации красителя над концентрацией кРНК). Для микрочипов гибридизации, это необходимо для достижения доходность не менее 825 нг и удельной активности, по крайней мере, 8 пмоль / мкг.
3. Microarray гибридизации
- Включите станцию гибридизации и установлена на уровне 65 ° С, по крайней мере за 2 часа до гибридизации начинается.
- Для подготовки гибридизации образца, смешайте следующие в 1,5 мл трубки:
- 825 нг Cy-3-кРНК (обычно, это ваш «лечил» образца)
- 825 нг Cy5-кРНК (обычно, это ваши "ссылки" образец)
- 11 мкл 10X блокировки агента.
- Добавить РНКазы без воды до конечного объема в 52,8 мкл
- Добавить 2,2 мкл буфера фрагментации.
- Vortex на низкой скорости перемешать.
- Инкубировать при 60 ° С в течение ровно 30 мин. Это шаг кРНК фрагментации, которая генерирует меченых фрагментов для массива гибридизации. Это очень важно для инкубации в точности, как описано. Мы рекомендуем использовать Термоциклер с подогревом крышкой. Это очень важно для инкубации точности, как описано для получения пробы правильной длины среднего. Чрезмерный или недостаточный фрагментация может привести к ложным негативы или ложных срабатываний.
- Добавить 55 мкл буфера 2X гибридизации, чтобы остановить фрагментацию. Смешать с помощью пипетки, уделяя особое внимание, чтобы не вводить пузыри.
- Центрифуга в течение 1 мин с максимальной скоростью, чтобы собрать информацию в нижней части трубы. Если пузыри наблюдаются, центрифуги больше времени, чтобы удалить их.
- Поместите пробирку на льду, защищенном от света. Нагрузка образца на массив как можно скорее.
- Чтобы загрузить массив, сначала подготовить гибридизации камеры. Этот протокол описывает использование массивов компании Agilent 4x44K с Рош-NimbleGen системы гибридизации и камер A4 смесителя.
- Место микрочипов слайда в сборке / разборке инструмента, штрих-код стороне первого.
- Открытое A4 смесителя и выставить клея. Холдинг массива и сборки / разборки инструмента, чтобы предотвратить любое движение, место A4 миксером на слайд, начиная с дальнего конца. Убедитесь, что он правильно ориентирован на инструмент. Придерживайтесь микшер с самого начала массива слайда.
- Вытяните с конца смеситель, чтобы удалить слайд / смесительной группой.
- Использование рев инструмент, нажмите на всем протяжении клейкой прокладки, чтобы убедиться, она плотно приклеен к theslide. Мелкие пузырьки воздуха в ловушке между клеем и слайдов можно увидеть на темном фоне. Возьмите дополнительное время, чтобы устранить эти пузырьки с рев инструмент. Ваш массив теперь готов быть загружены.
- Используйте положительные пипетки смещение нагрузки 100 мкл гибридизации образца. Нажмите на кончик плотно внутри порта отверстие, а затем отказаться медленно и плавно, так что воздух не попавшие в массиве области. Никогда не пытайтесь высосать образец резервного копирования. После всей выборке было обойтись, держите наконечник на порт отверстие, не отпуская поршень. Когда выборка охватывает весь массив и жидких начинает выходить вентиляционные порт, быстро удалять пипеткой. Только отпустите поршень раз наконечник от слайда.
- Аккуратно промокните излишки жидкости на обоих портах. Убедитесь, что вы не обратить образца из самой камере.
- Обложка иллюминаторы с наклейками с помощью пинцета.
- Положите скользить по гибридизации станции, и убедитесь, что мочевой пузырь отверстия правильно размещен над уплотнительные кольца. Это позволит обеспечить надлежащее перемешивание при гибридизации.
- Закройте крышку слайд-шоу и станции крышкой. Установите станцию режим смешивания Б.
- Скрещиваться массива при 65 ° С в течение 17 часов.
- Подготовка промывочного буфера 2 путем добавления Тритон Х-102 до конечной концентрации 0,005%. Хранить при температуре 37 ° С в течение ночи.
4. Microarray стиральных
- Добавить Тритон Х-102 для промывочного буфера 1 до конечной концентрации 0,005%. Хранить при комнатной температурe.
- При гибридизации закончена, заполнить стеклянную посуду "" с промывочного буфера 1. Блюдо должно быть достаточно большим, чтобы провести сборку / разборку инструмента и позволяют некоторым маневрирования, а также. Все мойки должно быть сделано в стеклянную посуду. Избегайте пластиковой посуды, так как они имеют тенденцию к выщелачиванию соединения что приводит к высоким фоном в массиве.
- Поместите стойку слайдов и мешалку в окрашивании блюдо "B". Залейте промывочного буфера 1, убедившись, что он охватывает стойку. Место на мешалки при комнатной температуре.
- Положите мешалкой на пустое блюдо окрашивания "С" и разместить на мешалки.
- Удаление массива и поместить его в сборку / разборку инструмента. Погрузите все собрание в блюдо "".
- Удерживая сборку / разборку инструмента и слайд с противоположных сторон с одной стороны, осторожно снимите A4 смесителя. Убедитесь, что вы не царапают массивов области.
- Быстро место слайда в стойке в окрашивании блюдо "B". С этого момента контакта с воздухом должен быть сведен к минимуму с Cy5 краситель чувствительны к озону. Не мойте более 8 массивов за один раз.
- Промыть в течение 1 минуты помешивая на средней скорости.
- Заполните окрашивания блюдо "С" с подогретого промывочного буфера 2. Передача слайдов и мыться в течение 1 минуты.
- Очень медленно удалить слайд стойку от окрашивания блюдо "C", чтобы минимизировать капли остались на слайде.
- Сухой слайд, крутя в течение 2 минут. При использовании совместимой центрифуги недоступен, центрифуги слайда в 50-мл коническую трубку или удар аргона над ним.
- Место слайдов в 50-мл коническую трубку и заполнить его газом аргоном. Сканирование немедленно, чтобы избежать потери сигнала. Мы рекомендуем использовать сканер GenePix 4000B из молекулярных устройств.
5. Представитель Результаты:
Хорошее качество общего образцов РНК должны производить только два основных пика, когда запущен в Bioanalyzer для контроля качества, соответствующей 2-х основных видов рибосомальной РНК. Некоторые деградации РНК покажет, как мазок до первого пика рибосомальной РНК. Серьезной деградации, низким качеством РНК покажет широкий пик или серии пиков при низких время удержания, в то время как 2 рибосомной РНК пики будет очень низкой интенсивности или его невозможно определить вообще. Примеры выхода Bioanalyzer 2100, см. рис 1.
Эксперт 2100 ПО рассчитает количество РНК целостности, или РИН, как количественного измерения качества РНК. Высокие образцы качества, со значениями РИН выше 9, очевидно, являются лучшими для микрочипов приложений. Тем не менее, мы использовали образцы со значениями РИН ниже, чем 5,2 в производстве микрочипов данных приемлемого качества.
Хорошие качества массивов должны производить высокое отношение сигнал при относительно низких значениях ФЭУ. В нашем эксперименте, большинство из стенограммы, как ожидается, присутствовать на том же уровне в экспериментальной и эталонного образца, огромные, широко распространенные изменения в экспрессии генов, вероятно, отсутствие какой-либо биологическое значение. Поэтому, большинство из массива должен выглядеть желтой, а не зеленый или красный. Хорошие сигналы качества должны также находиться в динамическом диапазоне, что сигнал гистограммы полностью перекрываются. Например, см. рисунок 2.
Рисунок 1. Пример четырех образцов РНК, выделенной из человеческих тканей опухоли головного мозга. РНК выделяли с использованием протокола представлены в 3.1.1. Пример качества оценивали с помощью 2100 Bioanalyzer на чипе РНК 6000, как описано в 3.1.3. Образцы представителем 4 различных качеств РНК: очень хорошее качество РНК (RIN> 9); B, частично деградированных РНК (РИН 5-6, обратите внимание, значительно ниже пика 28S рРНК), С, высокой степени деградации РНК (РИН < 3); D, почти полностью деградировали РНК (РИН = 2). Мы успешно использовали образцы с аналогичными качествами или лучше, чем B (RIN> 5,2) для последующих применений микрочипов. Твердые и открытые стрелки указывают положение 18S и 28S рРНК видов, соответственно.
Рисунок 2. Примеры массива изображений и графиков разброса. , Целые предпросмотра слайдов, показывая четыре массива в формате 4X44K Agilent, B, высокое разрешение сканирования одной из массива областях, обратите внимание, что ни один из сигналов (красный или зеленый) преобладает, C, точечной диаграммы изображения в B, обратите внимание, что сигналы полностью перекрываются и не более 1x10 -6 функции в насыщающей интенсивности.
Discussion
Выражение профилирования с помощью ДНК-микрочипов предлагает прямой подход к выявлению разному экспрессируются гены между двумя биологическими образцами. Успешные эксперименты профилирования выражения требуют высокого качества образцов РНК, надежной маркировки и гибридизации. По нашему опыту, коммерческих массивов и маркировке комплектов Agilent обеспечивают высокое качество данных по разумной цене. Хотя Agilent также предлагает своим гибридизации и сканирующей техники, мы выступаем за гибридизации системы от Рош-NimbleGen и GenePix 4000B микрочипов сканер от Molecular Devices. Обратите внимание, что Рош-NimbleGen гибридизации блок ранее был известен как системы гибридизации Мауи. После недавнего приобретения корпоративных Roche, A4 смесители было прекращено. По состоянию на момент написания этой статьи, они все еще могут быть найдены через других продавцов, таких как Kreatech Диагностика ( www.kreatech.com , это веб-сайт также предлагает удобный инструмент совместимости массив), однако при длительном наличие на складе является неопределенным. Другие системы гибридизации доступны (например, от компании Agilent), однако, если это совместимо смесители могут быть найдены для массива используется, мы рекомендуем системой Roche-NimbleGen за его качество и воспроизводимость.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами для ED с Джеймсом С. McDonnell фонд 21-го века Программа премии, премии и Нью-Новатор NIH директора. GAB была частично поддержана докторской стипендии из Калифорнийского института регенеративной медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
| 2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
| Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
| Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
| Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
| Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
| A4 mixer hybridization chambers | |||
| Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
| Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
| Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
| Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
| Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
| GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
References
- Diaz, E. One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease. Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).
- Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).
- Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).
