Summary
Een manier om de integratie van de pasgeborene dentate granule cellen studie bij volwassen dieren is beschreven. Deze techniek maakt gebruik van een retrovirus ontworpen voor pasgeboren neuronen, gevolgd door elektrofysiologische opnames om te bepalen in vivo functionele integratie label.
Abstract
Neurogenese voorkomt bij volwassen zoogdieren hersenen in de sub-ventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikel en in de sub-korrelige zone (SGZ) van de hippocampus dentate gyrus gedurende het hele leven. Eerdere rapporten is gebleken dat volwassen hippocampus neurogenese wordt in verband gebracht met diverse hersenaandoeningen, zoals epilepsie, schizofrenie, depressie en angst (1). Ontcijfering van het proces van normale en afwijkende volwassenen geboren neuron integratie kan licht werpen op het ontstaan van deze ziekten en de hoogte van de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
SGZ volwassen neurogenese spiegels embryonale en postnatale neuronale ontwikkeling, met inbegrip stadia van het lot specificatie, migratie, synaptische integratie en rijping. De volledige integratie gebeurt over een langere, periode van 6 weken. Eerste synaptische input voor volwassenen geboren SGZ dentate granule cellen (DGCs) is GABA-erge, gevolgd door glutamaat input op 14 dagen (2). De specifieke factoren die de vorming van volwassen circuit geboren neuronen in de dentate gyrus regelen zijn op dit moment onbekend.
Ons laboratorium maakt gebruik van een replicatie-deficiënte retrovirale vector gebaseerd op het Moloney murine leukemie virus naar fluorescerende eiwitten en veronderstelden regulerende genen te leveren aan deze prolifererende cellen. Deze virale techniek zorgt voor een hoge specificiteit en resolutie voor de analyse van cel geboortedatum, geslacht, morfologie, en synaptogenese.
Een typisch experiment maakt gebruik van vaak twee of drie virussen met uniek label, transgene en promotor elementen voor single-cell analyse van een gewenste ontwikkelingsproces in vivo. Het volgende protocol beschrijft een methode voor het analyseren van functionele pasgeboren neuron-integratie met een enkele groen (GFP) of rood (dTomato) fluorescent eiwit retrovirus en patch-clamp elektrofysiologie.
Protocol
1. Virusinjectie
High-titer engineered retrovirus (1 × 10 9 eenheden / ml) wordt geproduceerd door co-transfectie van retrovirale vectoren en VSVG in HEK293T cellen, gevolgd door ultracentrifugatie van virale supernatant. Voor bronnen en productiemethoden, zie het uitstekende Jupiter demonstratie (3).
Let op: Jonge volwassenen (4-6 weken oud) vrouwelijke C57Bl / 6 muizen (Charles River) zijn gehuisvest onder standaard condities. Alle procedures volgen de National Research Council's Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren in een protocol is goedgekeurd door de Stony Brook University IACUC.
- Ontdooi 2ul van bevroren retrovirus per dier op het ijs.
- Verdoof (100 ug ketamine + 10 ng xylazine per gram lichaamsgewicht) en monteer het dier op een stereotaxisch frame (Steolting). Verwijder het haar op het hoofd en veeg de huid met 70% ethanol.
- Expose de schedel en boor de vier ondiepe gaten met behulp van een tandartsboor (0,6 mm boortje) op de volgende coördinaten:
- anterioposterior = -2 mm van bregma; zijwaartse = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm van bregma; zijwaartse = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm.
- anterioposterior = -2 mm van bregma; zijwaartse = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm van bregma; zijwaartse = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm.
- Monteer een 1μl Hamilton, flat-tip spuit en injecteer 0,5 ul retrovirus per locatie met een snelheid van 0,25 pl / min in de dentate gyrus. (Zie de bovenstaande coördinaten voor de buik diepte.) Pauze 2 minuten na elke injectie voor langzaam het intrekken van de spuit om de vloeistof terugstroming te voorkomen. Tussen de injecties, kort spoel de buitenkant van de spuit met steriel PBS en een applicator om sporen van bloed te verwijderen.
- Sluit de wond met steriel chirurgisch hechtmateriaal (type P-1, afmeting 6-0) en het dier terug te keren naar standaard huisvesting tot de gewenste tijd stadia na de injectie.
2. Slice Voorbereiding
Voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige acute segmenten van volwassen muizen, gebruiken we een aangepaste snij-oplossing voor slice voorbereiding (zie hieronder).
- Pre-chill snijden oplossing voor 0-4 ° C op ijs en bel met 95% O 2 -5% CO 2 voor ten minste 30 minuten.
- Verdoven en transcardially perfuseren een dier met ijskoude zuurstof verzadigde oplossing te snijden.
- Snel te verwijderen van de hersenen in een petrischaal met filtreerpapier pre-bevochtigd met koude, zuurstofrijke snijden oplossing. Snijd het cerebellum en plak een montagevlak minstens 1 mm juist voor de (zichtbare) injectie coördinaten. Lijm de hersenen op een vibrotome podium en monteer het in de snij-kamer gevuld met koude en zuurstofrijke snijden oplossing.
- Bereid coronale of horizontale plakken (300-350μm) en breng ze met een grote boring pipet om een incubatie kamer met kamertemperatuur ACSF borrelen met 95% O 2 / 5% CO 2.
- Incubeer de plakjes, borrelende continu, bij 32 ° C gedurende 30-60 minuten. Ga terug de kamer op kamertemperatuur voor de duur van de opname.
3. Elektrofysiologische experimenten
- Slices worden overgedragen in de opname kamer die voortdurend wordt met zuurstof verzadigde ACSF doorbloed bij 32 ° C - 34 ° C.
- Een bipolaire stimulatie wolfraam elektrode wordt geplaatst in de moleculaire laag van de dentate gyrus met behulp van een lage vergroting microscoop objectief (10X).
- Pasgeboren DGCs in de sub-korrelige zone / granulaire cellaag worden geïdentificeerd door de expressie van GFP of dTomato. Whole-cell patchclamp opname wordt uitgevoerd op pasgeboren neuronen onder hoge vergroting (40X).
- Firing eigenschappen van de opgenomen cellen worden verkregen door injectie van een reeks van stromingen onder de huidige-klem-modus.
- Elektrische prikkels worden geleverd door de stimulatie elektrode via een stimulatie isolator gecontroleerd door de opname-software, en opgeroepen postsynaptische stromingen in de pasgeborene DGCs worden vastgelegd.
4. Data Analysis
Amplitudes van de opgeroepen postsynaptische reacties geanalyseerd worden in de verschillende ontwikkelingsstadia van de volwassen geboren neuronen.
5. Representatieve resultaten
Met de bovengenoemde protocol, GFP expressie in pasgeboren dentate gyrus neuronen vergelijkbaar met Figuur 1 is gemeenschappelijk. Merk op dat pasgeboren neuronen makkelijk kunnen worden gevisualiseerd en zowel dendrieten en axonen strikt worden geëtiketteerd. Expressie in dunne DGC axonen en kleine stekels hangt af van de kwaliteit en de titer van het virus, die de promotor en de lengte van de in vivo expressie. In onze handen, pasgeboren cellen en sub-cellulaire organellen zijn meestal zichtbaar zijn binnen een paar dagen na de injectie, en de wervelkolom expressie kan worden getraceerd vanaf de vroegste stadia van ontwikkeling. Whole-cel opnamen van pasgeboren neuronen op verschillende tijdstippen stadia kan de studie van de unieke pasgeboren cel eigenschappen, bijvoorbeeld actiepotentialen (Figuur 2a), evenals het proces van synaptische integratie in bestaande neurale circuits tijdens de rijping (Figuur 2b).
Figuur 1 twee-foton confocale beeld van de pasgeboren neuronen in een horizontale dentate gyrus deel van een volwassen muis. Groene cellen zijn 21dpi (dagen na de injectie) GFP-expressie pasgeboren DGCs gelabeld met Pux-GFP retrovirus.
Figuur 2 a) actiepotentiaal afvuren eigenschappen van een pasgeboren DGC op 21 dpi. B) vertegenwoordiger opgeroepen prikkelende postsynaptische stroom (EPSCs) opgenomen op een pasgeboren DGC op 21 dpi.
Discussion
Continu neurogenese in de hippocampus van volwassen zoogdieren hersenen biedt een uniek experimenteel model systeem om neuronale ontwikkeling en integratie in de volwassen hersenen te bestuderen. Het protocol hier gepresenteerde combinatie van retrovirale etikettering en de elektrofysiologische methoden om de integratie van de pasgeborene dentate granule neuronen in de hersenen van volwassen muizen te bestuderen.
Om ervoor te zorgen dat uw experimenten succesvol zijn, raden wij de volgende tijdens kritieke fasen van de procedure:
Om te voorkomen dat ongewenste infectie en ontsteking, moeten alle gereedschappen gesteriliseerd worden (de autoclaaf, elk type sterilisator, of 70% ethanol) voor de operatie. Gebruik steriel PBS tot de punt van de naald te wassen voor injectie.
Voor virus injectie moeten de dieren goed worden gemonteerd op de stereotaxische apparaat en bronnen van onnodige beweging moet worden geminimaliseerd tijdens de injectie. Zorg ervoor dat het hoofd goed vast en stevig, en pas de neus positie van de muis naar niveau bregma en lambda voorafgaand aan de berekening van de injectie coördinaten. Extract virus in de spuit snel naar de blootstelling aan kamertemperatuur te minimaliseren - retrovirussen zijn bijzonder temperatuur gevoelig. Injecteer langzaam virus bij de aanbevolen snelheid om de druk schade te minimaliseren. Met behulp van de aanbevolen platte spuit (vs. gemeenschappelijke afgeschuinde tip) zal zorgen voor een gelijkmatige verdeling van dentate gyrus infectie gebied.
Alvorens plakken, moet snijden oplossing en incuberen ACSF te borrelen met 95% O 2 -5% CO 2 gedurende tenminste 30 minuten om zuurstof aan de oplossingen te verzadigen. De dieren moeten snel worden geperfundeerd en weefsel onderhouden in koude, zuurstof-verzadigde oplossing voor de beste slice kwaliteit.
Voor het opnemen, geleidelijk verhogen van de stimulus intensiteit totdat er een postsynaptische antwoord. Verander de locatie van de stimulatie-elektrode in de moleculaire laag van de dentate gyrus als nodig is.
Kortom, de aanbevolen aanpak biedt een manier om de verschillende eigenschappen en mogelijke functionele rol van de volwassen geboren neuronen ontdekken tijdens een vroeg stadium integratie in de actieve, volwassen circuit.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NINDS en American Heart Association S.Ge. Deze aanpak was oorspronkelijk opgericht en ontwikkeld door de auteur in het laboratorium van Dr Hongjun Song's in het Johns Hopkins University. We willen graag Dr Hongjun Song bedanken voor zijn begeleiding en ondersteuning.
Materials
|
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain. Nature. 439, 589-593 (2006).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
