Summary
Способ изучения интеграции новорожденных зубчатой ЗК у взрослых животных описывается. Эта техника использует инженерии ретровируса маркировать новорожденных нейронов, а затем электрофизиологические записи, чтобы определить в естественных условиях функциональной интеграции.
Abstract
Нейрогенез происходит у взрослых млекопитающих мозги в суб-желудочковой зоны (СВЗ) бокового желудочка и в суб-зернистый зоны (SGZ) в зубчатой извилине гиппокампа в течение всей жизни. Предыдущие отчеты показали, что взрослые гиппокампа нейрогенеза связана с различными расстройствами мозга, в том числе эпилепсия, шизофрения, депрессия и тревога (1). Расшифровка процесс нормальный и аберрантных взрослых родился нейрона интеграции, может пролить свет на этиологию этих заболеваний и учтены при разработке новых методов лечения.
SGZ взрослого нейрогенеза зеркала эмбриональное и послеродовое развитие нейронов, в том числе этапы судьбы спецификации, миграция, синаптической интеграции и созревание. Тем не менее, полная интеграция происходит в течение длительного, 6-недельный период. Первоначальные синаптической вход взрослым родился SGZ зубчатой ЗК (РСК) является ГАМК, а затем глутаматергической вход через 14 дней (2). Специфические факторы, которые регулируют схема образования взрослых родился нейронов в зубчатой извилине в настоящее время неизвестны.
Наша лаборатория использует репликацию с дефицитом ретровирусные вектора на основе Молони мышиного вируса лейкемии доставить флуоресцентных белков и предположили регуляторных генов этих пролиферирующих клеток. Это вирусная технология обеспечивает высокую специфичность и разрешение для проведения анализа клеточных дата рождения, происхождение, морфологии и синаптогенез.
Типичном эксперименте часто используют два или три вирусов содержащие уникальный лейбл, трансгенов, и промоутер элементы для одноклеточных анализ желаемого процесса развития в естественных условиях. Следующий протокол описывает метод анализа функциональной интеграции новорожденных нейронов с помощью одного зеленого (GFP) или красный (dTomato) флуоресцентного белка ретровируса и патч-зажим электрофизиологии.
Protocol
1. Вирус инъекций
Высокого титра инженерии ретровируса (1 × 10 9 ед / мл) производится котрансфекцию ретровирусных векторов и VSVG в HEK293T клетки, а затем ультрацентрифугирования вирусного супернатанта. Для источников и методов производства, см. в превосходной демонстрацией Юпитер (3).
Примечание: молодые взрослые (4-6 недель) женщина C57Bl / 6 мышей (Charles River) размещаются в стандартных условиях. Все процедуры следуют Руководство Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных под протоколом утвержденным Stony Brook University IACUC.
- Оттепель 2UL замороженных ретровируса на одно животное на льду.
- Анестезировать (100 мкг кетамин + 10 мкг на грамм ксилазина массы тела) и смонтировать животное на стереотаксической рамы (Steolting). Удаление волос на голове и протирать кожу 70% этанола.
- Expose черепа и просверлите четыре отверстия мелкой использования бормашины (0,6 мм сверло) по следующим координатам:
- anterioposterior = -2 мм от брегмы, боковые = ± 1,6 мм, нижний = 2,5 мм; anterioposterior = -3 мм от брегмы, боковые = ± 2,6 мм, нижний = 3,2 мм.
- anterioposterior = -2 мм от брегмы, боковые = ± 1,6 мм, нижний = 2,5 мм; anterioposterior = -3 мм от брегмы, боковые = ± 2,6 мм, нижний = 3,2 мм.
- Горы 1 мкл Hamilton, телевизор с плоским наконечником шприца и вводят 0,5 мкл ретровируса на участок в размере 0,25 мкл / мин в зубчатой извилине. (См. выше координаты вентральной глубину.) Пауза 2 минуты после каждой инъекции перед медленно снятии шприца для предотвращения обратного потока жидкости. Между инъекциями, кратко ополосните внешнюю поверхность наконечника шприца стерильной PBS и аппликатор для удаления следов крови.
- Закрыть рану стерильным хирургический шовный материал (тип П-1; Размер 6-0) и вернуть животное к стандартным условиям жилья до нужного времени этапах после инъекции.
2. Подготовка фрагментов
Для получения высококачественных острых ломтики от взрослых мышей, мы используем модифицированный резки решение для среза подготовки (см. ниже).
- Предварительное охлаждение режущего решение до 0-4 ° С на льду и пузырь с 95% O 2 -5% CO 2 в течение 30 минут.
- Анестезировать и transcardially заливать животное с ледяной насыщенных кислородом резки решение.
- Быстро удалить мозг в Петри-блюдо с фильтровальной бумаги предварительно смоченную холодной, насыщенной кислородом резки решение. Отрежьте мозжечка и нарезать монтажной поверхности не менее 1 мм впереди (видимый) введение координат. Клей мозга на стадии vibrotome и смонтировать его в камеру дробления заполнена холодной и кислородом резки решение.
- Подготовка корональной или горизонтальных ломтиков (300-350μm) и передавать их с большого диаметра пипетки на камеру, содержащую инкубации при комнатной температуре ACSF пузырилась с 95% O 2 / 5% СО 2.
- Инкубируйте ломтиками, бурлящие непрерывно, при 32 ° С в течение 30-60 минут. Вернуться камере до комнатной температуры в течение всего срока регистрации.
3. Электрофизиологические эксперименты
- Фрагменты передаются в записи камеру, которая постоянно озарен насыщенных кислородом ACSF при 32 ° C - 34 ° C.
- Стимуляции биполярного вольфрамовый электрод помещается в молекулярном слое зубчатой извилины использованием низких микрообъектива увеличением (10х).
- Новорожденные РСК в суб-зернистый зоны / зернистого слоя ячейки обозначаются выражением GFP или dTomato. Всего-клеточные patchclamp запись выполняется на новорожденных нейронов при большом увеличении (40х).
- Стрельба свойства записаны клетки получаются путем введения ряда течений в соответствии с действующим зажим режиме.
- Электрические стимулы доставляются стимуляции электрод через стимуляцию изолятор контролируется программное обеспечение для записи, и вызвала постсинаптических токов в РСК новорожденных регистрируются.
4. Анализ данных
Амплитуды вызвала постсинаптические ответы анализируются на разных стадиях развития взрослого родился нейронов.
5. Представитель Результаты
Использование протокола выше, GFP выражение у новорожденных нейронов зубчатой извилины как на рисунке 1 является распространенным явлением. Обратите внимание, что новорожденного нейроны легко визуализировать и оба дендритов и аксонов таких стратегий прочно маркированы. Выражение в тонких ДГК аксонов и малых шипов зависит от качества и титр вируса, промоутер используются и длиной в живом выражении. В наших руках, новорожденных клеток и субклеточных органелл, как правило, видимых в течение нескольких дней после инъекции, и позвоночник выражение может быть прослежена от самых ранних стадиях развития. Wотверстие-клеточной записи с новорожденным нейронов на разных этапах времени позволяют изучения уникальных свойств новорожденных клетки, например, потенциалы действия (рис. 2а), а также процесс синаптической интеграции в существующие нейронные цепи во время созревания (рис. 2б).
Рис 1 2-фотон конфокальной образ новорожденных нейронов в горизонтальной зубчатой извилине разделе взрослой мыши. Зеленые клетки 21dpi (дней после инъекции) GFP-экспрессирующих новорожденных РСК помечены pUX-GFP ретровируса.
Рисунок 2) потенциал действия стрельбы свойства новорожденных DGC в 21 точек на дюйм. Б) представителя вызвала возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs), записанной на новорожденного DGC в 21 точек на дюйм.
Discussion
Непрерывная нейрогенез в гиппокампе взрослых млекопитающих мозг дает уникальную экспериментальную систему моделью для изучения нейронных развития и интеграции в зрелом мозге. Протокол, представленные здесь сочетаются ретровирусных маркировки и электрофизиологических методов исследования интеграции новорожденных нейронов зубчатой гранул в мозге взрослых мышей.
Чтобы убедиться, что ваши эксперименты пройдут успешно, мы рекомендуем следующие в критические этапы процедуры:
Чтобы избежать нежелательных инфекций и воспалений, все инструменты должны быть стерилизованы (автоклавированием, любой тип стерилизатор, или 70% этанола) до операции. Используйте стерильные PBS мыть кончике иглы шприца перед инъекцией.
Для вируса инъекции, животные должны быть хорошо установлен на стереотаксического устройства и источники лишних движений должны быть сведены к минимуму во время инъекции. Убедитесь, что голова хорошо фиксированной и фирмы, а также настроить нос положение мыши на уровень брегмы и лямбда до расчета координат инъекции. Извлечение вирус в шприце быстро, чтобы минимизировать воздействие до комнатной температуры - ретровирусы, которые особенно чувствительны к перепадам температур. Inject вирус медленно рекомендуемая скорость, чтобы минимизировать давление повреждения. Использование рекомендованных плоским наконечником шприца (по сравнению с общим скошенным кончиком) обеспечит равномерно распределяется зубчатой извилине области инфекции.
Перед приготовлением ломтиками, резка решение и инкубации ACSF должны быть клокотало с 95% O 2 -5% CO 2 в течение 30 минут, чтобы насытить кислородом решений. Животные должны быть быстро и перфузии тканей поддерживаться в холодном, кислородно-насыщенный раствор для лучшего среза качества.
Для регистрации, увеличение интенсивности раздражения постепенно, пока не будет постсинаптического ответа. Изменение расположения стимуляции электродов в молекулярном слое зубчатой извилины по мере необходимости.
Таким образом, рекомендуемый подход предлагает способ для изучения различных свойств и возможных функциональных ролей взрослого родился нейронов во время ранней стадии интеграции в активной, зрелой схемы.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NINDS и Американской ассоциации сердца к S.Ge. Этот подход был изначально создан и разработан автором в лаборатории доктора Хунцзюнь песни в Университете Джона Хопкинса. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Хунцзюнь Песня для его руководство и поддержку.
Materials
|
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain. Nature. 439, 589-593 (2006).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
