Summary
Ett sätt att studera integrationen av nyfödda dentate granule celler i vuxna djur beskrivs. Denna teknik använder en konstruerad retrovirus att märka nyfödda nervceller, följt av elektrofysiologiska inspelningar för att avgöra in vivo funktionell integration.
Abstract
Neurogenes förekommer hos vuxna däggdjur hjärnor i sub-ventrikulära zonen (SVZ) av den laterala ventrikeln och i sub-granulat zon (SGZ) av hippocampus dentate gyrus hela livet. Tidigare rapporter har visat att vuxna hippocampus neurogenes är förknippad med olika hjärnsjukdomar, inklusive epilepsi, schizofreni, depression och ångest (1). Dechiffrera den process av normala och avvikande vuxna födda neuron integration kan belysa etiologin till dessa sjukdomar och informera om utvecklingen av nya behandlingsmetoder.
SGZ vuxen neurogenes speglar embryonala och postnatal neuronala utveckling, inklusive stadier av ödet specifikation, migration, synaptisk integration och mognad. Dock sker en fullständig integration under en längre, 6-veckors period. Inledande synaptiska ingång till vuxna födda SGZ dentate granulat celler (DGCs) är GABAergic, följt av glutamaterg ingången på 14 dagar (2). De specifika faktorer som reglerar krets bildandet av vuxna födda nervceller i dentate gyrus är för närvarande okända.
Vårt laboratorium använder en replikering-brist retrovirus vektor baserad på Moloney mus leukemi-virus för att leverera fluorescerande proteiner och hypoteser reglerande gener till dessa celler som förökar sig. Detta virus Tekniken ger hög specificitet och upplösning för analys av celler födelsedatum, härstamning, morfologi och synaptogenesis.
Ett typiskt experiment använder ofta två eller tre virus med unik etikett, transgen och element promotor för encelliga analys av en önskad utvecklingsprocess in vivo. Följande protokoll beskriver en metod för att analysera funktionella nyfödda neuron integration med en enda grön (GFP) eller röd (dTomato) fluorescerande protein retrovirus och patch-clamp elektrofysiologi.
Protocol
1. Virus Injection
Hög titer konstruerad retrovirus (1 × 10 9 enhet / ml) är producerad av co-transfektion av retrovirala vektorer och VSVG in HEK293T celler, följt av ultracentrifugering av viral supernatant. För källor och produktionsmetoder, se den utmärkta JUPITER demonstration (3).
OBS: Unga vuxna (4-6 veckor gammal) hona C57BL / 6 möss (Charles River) är inhysta under normala förhållanden. Alla förfaranden följer det nationella Vetenskapsrådets guide för vård och användning av försöksdjur i ett protokoll som godkänts av Stony Brook University IACUC.
- Tina 2ul av frysta retrovirus per djur på is.
- Bedöva (100 mikrogram ketamin + 10 mikrogram xylazin per gram kroppsvikt) och montera djur på en stereotaxic ram (Steolting). Ta bort hår på huvudet och torka av huden med 70% etanol.
- Avslöja skallen och borra fyra grunda hål med en Tandläkarborrmaskiner (0,6 mm borr) på följande koordinater:
- anterioposterior = -2 mm från bregma; sidled = ± 1,6 mm, ventral = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm från bregma; sidled = ± 2,6 mm, ventral = 3,2 mm.
- anterioposterior = -2 mm från bregma; sidled = ± 1,6 mm, ventral = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm från bregma; sidled = ± 2,6 mm, ventral = 3,2 mm.
- Montera en 1μl Hamilton, platt-tip spruta och injicera 0,5 l retrovirus per plats med en hastighet av 0,25 l / min i dentate gyrus. (Se ovan koordinaterna för ventrala djup.) Paus 2 minuter efter varje injektion innan långsamt dra tillbaka i sprutan för att förhindra att vätskan rinner tillbaka. Mellan injektionerna, kortfattat skölj utsidan av sprutan med steril PBS och en applikator för att avlägsna spår av blod.
- Stäng såret med sterila kirurgiska suturmaterial (typ P-1, storlek 6-0) och tillbaka djuret till standard bostadsförhållanden tills önskad tid stadierna efter injektionen.
2. Slice Förberedelser
För att få hög kvalitet akut skivor från vuxna möss använder vi en modifierad lösning för kapning för bit beredning (se nedan).
- Pre-chill lösning för kapning till 0-4 ° C på is och bubbla med 95% O 2 -5% CO 2 i minst 30 minuter.
- Bedöva och transcardially BEGJUTA ett djur med iskall syremättat lösning för kapning.
- Snabbt bort hjärnan i en Petri-skål med filter-papper pre-fuktad med kallt, syrerikt lösning för kapning. Skär av lillhjärnan och skiva en monteringsyta minst 1 mm främre till (synliga) injektion koordinater. Limma hjärnan på en vibrotome scenen och montera in den i klippkammare fylld med kallt och syrerikt lösning för kapning.
- Förbered koronalt eller horisontella skivor (300-350μm) och för över dem med en stor bar pipett till en inkubering kammare som innehåller rumstemperatur ACSF bubblade med 95% O 2 / 5% CO 2.
- Inkubera skivor, bubblande kontinuerligt, vid 32 ° C i 30-60 minuter. Återgå kammaren till rumstemperatur under hela inspelningen.
3. Elektrofysiologiska experiment
- Segment överförs till inspelningen kammare som kontinuerligt perfusion med syremättat ACSF vid 32 ° C - 34 ° C.
- En bipolär volfram stimulering elektrod placeras i den molekylära lagret av dentate gyrus använda en låg målsättning förstoring mikroskop (10X).
- Nyfödd DGCs i sub-granulat zon / granulat cellager identifieras genom uttryck av GFP eller dTomato. Helcells-patchclamp inspelning sker på nyfödda nervceller under hög förstoring (40x).
- Firing egenskaper inspelade celler erhålls genom injektion av en serie av strömmar enligt nuvarande-clamp läge.
- Elektrisk stimuli levereras av stimulering elektroden via en stimulering frånskiljare kontrolleras av inspelningsprogram, och väckte postsynaptiska strömmar i det nyfödda DGCs registreras.
4. Data Analysis
Amplitud av evoked postsynaptiska svaren analyseras på olika utvecklingsstadier av vuxna födda nervceller.
5. Representativa resultat
Med hjälp av ovanstående protokoll är GFP uttryck i nyfödda dentate gyrus nervceller liknande figur 1 vanligt. Observera att nyfödda nervceller är enkelt visualiseras och både dendriter och axoner är kraftigt märkta. Uttryck i tunna DGC axoner och små taggar beror på kvaliteten och titer av viruset, promotorn som används och längden på in vivo-uttryck. I våra händer, nyfödda celler och sub-cellulära organeller är oftast synliga inom några dagar efter injektion, och ryggrad uttryck kan spåras från de tidigaste stadierna av utveckling. Whole-cell inspelningar från nyfödda nervceller vid olika tidpunkter stadier möjliggöra studier av unika nyfödda cellens egenskaper, t.ex. potentialer åtgärder (figur 2a), liksom arbetet med synaptiska integrering i befintliga nervbanor vid mognad (Figur 2b).
Figur 1 2-fotonen konfokala bild av nyfödda nervceller i ett horisontell dentate gyrus avsnitt av en vuxen mus. Gröna celler 21dpi (dagar efter injektionen) GFP-uttryckande nyfödda DGCs märkta med pUX-GFP retrovirus.
Figur 2 a) Åtgärd potentiell bränning egenskaper hos en nyfödd DGC på 21 dpi. B) representativa framkallat excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) inspelade på en nyfödd DGC vid 21 dpi.
Discussion
Kontinuerlig neurogenes i hippocampus hos vuxna däggdjur hjärnor ger en unik experimentell modell för att studera neuronala utveckling och integration i den mogna hjärnan. Protokollet presenteras här kombinerar retrovirus märkning och elektrofysiologiska metoder för att studera integrationen av nyfödda dentate granule nervceller i hjärnan hos vuxna möss.
För att säkerställa att dina experiment är framgångsrika, rekommenderar vi följande under kritiska steg i förfarandet:
För att undvika oönskad infektion och inflammation, skall alla verktyg steriliseras (genom autoklavering, någon typ av autoklav, eller 70% etanol) före operationen. Använd sterila PBS för att tvätta toppen av injektionsnålen före injektion.
För virus injektion, måste djuren vara väl monteras på stereotaxic enheten och källor till onödiga förflyttningar måste minimeras under injektion. Se till att huvudet är väl fast och fast, och justera näsan position musen till nivå bregma och lambda före beräkning injektion koordinater. Utdrag viruset i sprutan snabbt att minimera exponeringen för rumstemperatur - retrovirus är särskilt temperaturkänsliga. Injicera viruset långsamt den rekommenderade mängden för att minimera trycket skador. Använda rekommenderade platt spets spruta (vs vanlig avfasade spetsen) kommer att säkerställa ett jämnt fördelad dentate området gyrus infektion.
Innan du förbereder skivor, måste skära lösning och inkubationstiden ACSF bubblas med 95% O 2 -5% CO 2 i minst 30 minuter så att syre att mätta lösningar. Djuren bör perfusion snabbt och vävnad kvar i kalla, syremättat lösning för bästa skiva kvalitet.
För inspelning, öka stimulusintensitet gradvis tills det finns en postsynaptiska svar. Ändra platsen för stimulering elektroden inom molekylära lagret av dentate gyrus som behövs.
Sammanfattningsvis ger den rekommenderade metoden ett sätt att utforska olika egenskaper och möjliga funktionella roller för vuxna födda nervceller under tidig integrering i aktiva, mogna kretsar.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NINDS och American Heart Association att S.Ge. Detta tillvägagångssätt upprättades ursprungligen och utvecklats av författaren i Dr Hongjun Song: s laboratorium i Johns Hopkins University. Vi vill tacka Dr Hongjun sång för hans vägledning och stöd.
Materials
|
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain. Nature. 439, 589-593 (2006).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
