Summary
Bu yöntem, Organotipik serebellar kültürlerin üretimi ve farklı serebellar hücre tiplerinin canlılığı belli apoptotik uyaranların etkisi açıklanmıştır.
Abstract
Nöronal doku Organotipik kültürleri, ilk kez 1947 1,2 Hogue tarafından tanıtıldı ve nörobilim alanında önemli bir atılım teşkil etmiştir . O zamandan beri, bu teknik daha da geliştirilmiş ve henüz Organotipik kültürleri hazırlamak için birçok farklı yolu vardır. Stoppini ve arkadaşları tarafından açıklanan bir uyarlanmış yöntemi burada sundu. Dilimleri hazırlanması ve Gogolla ark. Boyama işlemi 3,4 için.
Bu tekniğin eşsiz bir özelliği, tüm hücresel organizasyonu ve nöron ağları bozulduğu olduğu ayrışmış kültürleri üzerinde büyük bir avantaj sağlayarak, kendi özgün yapısı hipokampus ve serebellum gibi beynin farklı yerlerinde çalışmaya olanak veren. Serebellumun durumda Purkinje hücrelerinin çalışma, ayrışmış temel kültür olarak elde etmek için son derece zor izin verdiğinden bile daha avantajlıdır. Bu yöntem, in vitro olarak serebellum bazı gelişimsel özellikleri yanı sıra çalışmada, yabani tip ve mutant fareler hem de elektrofizyolojik ve farmakolojik deneyler için kullanılabilir .
Apoptotik hücre ölümü ölçmek için TUNEL boyama yöntemi, burada açıklanan, gelişmekte olan beyincik Fas ligand olarak apoptotik uyaranlara etkisini araştırmak için dizayn edilmiştir. TUNEL boyama gibi Calbindin Purkinje hücreleri için hücre tipi özgül belirteçler ile birlikte ise, bir hücre popülasyonu belirli bir şekilde hücre ölümünü değerlendirmek mümkündür. Calbindin boyama da serebellar kültürlerin kalitesini değerlendirmek amacıyla hizmet vermektedir.
Protocol
1. Organotipik Serebellar Kültürler:
- Organotipik serebellar kültürler başarıyla oluşturmak için P0-P3 veya P8-P12 arasındaki fareler kullanın. Deneme için bu gelişimsel aşamada, bizim çalışmamız için daha uygun olması nedeniyle, P8-P12 serisi fareler kullanıldı.
- Diseksiyon ve kültür ortamı hazırlayın:
- Beyin diseksiyonu ve dilim hazırlama 1mm kalsiyum klorür içeren düşük sodyumlu Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (ACSF), 10mM D-Glukoz, 4mm potasyum klorür, 5mM magnezyum klorür, 26mm sodyum bikarbonat, 246mM sakaroz ve fenol kırmızısı çözeltisi (1:1000) yürütülmektedir pH 7.3. Çözüm sterilize etmek için, 4 .22 mikron filtre ve mağaza üzerinden filtre ° C
- Serebellar dilimleri% 75 Minimum Essential Orta Kartalı (MEM),% 25 ısı ile inaktive edilmiş at serumu, 25mm Hepes, 1mm glutamin, 5 mg / ml glikoz, penisilin (100 U / ml) ve streptomisin (100 U / ml) kültür. Iki hafta en fazla 4 0.22 mikron filtre ve mağaza ° C ile orta Filtresi.
- Kırmızıdan turuncuya kayacak önceden Carbogen (% 95 oksijen ve% 5 karbon dioksit) Not kabarmış buz ACSF orta beyin teşrih, Carbogen doyma çözeltinin pH değişecek. Diseksiyonu beyin yapısına zarar vermemek için dikkatli olmak mümkün zaman minimum tutar yapılmalıdır.
- Vibratome kullanarak 400 mikron sagital bölümlerde beyin dilimleyin.
- Beyincik mümkün olduğunca az kesmeye çalışırken bir yarımkürede bir jilet ile sagital kesme olun; bu dilimleme için düz bir yüzey sağlayacaktır. Korteks destek için dilimleme kolaylaştırmak için kullanılır ama zaman önemli bir konudur çünkü bir jiletle kesip korteksin rostral yarısında daha uygun.
- (Superglue), metal vibratome plaka üzerinde beyin konumunu düzeltmek için siyanoakrilat kullanın. Tutkal eklemeden önce buz üzerinde plaka soğuk ve ince bir yapışkan tabaka oluşturacak şekilde tüp ucunu kullanarak iyi yaymak için çok önemlidir. Superglue fazlalığı varsa ACSF ve örnek kaybolur temas geldiğinde, plaka terketmez.
- Sonra beyin, beyin kapak ve levha, soğuk tutmak için aşağıda buz koymak için yeterli ACSF medya eklemek vibratome plaka takılı.
- 400 mikron dilim kesin ve bir plastik Pasteur pipeti (genişletmek ve dilimleri zarar görmesini önlemek için ucu kesilmiş) 6-iyi hücre kültürü plaka buz üzerinde ACSF içeren bir transfer.
- Diseksiyon mikroskobu altında iki insülin şırıngaları (28 gauge iğne ile küçük çaplı şırınga) yardımıyla beynin geri kalanı beyincik ayırın. Bazı dilim superglue kenarlarına bağlı olacaktır: Bu dilim canlılığı etkileyebilir olarak kaldırmak için denemek için bir an. Serebellar yapıya zarar vermeden dikkatli bir şekilde bunu yapmak için çok önemlidir.
- 0.4 mikron gözenekleri ile 30mm kültür plaka ekler içeren 6-kuyucuğu serebellar dilim aktarın. 1 ml kültür ortamı başına iyi, 37 en az 2 saat süreyle inkübasyon tarafından önceden klimalı ° C ve% 5 CO 2 (hücre kültürü inkübatörde). Ekler altında hapsolmuş hava kabarcıkları ve daha sonra tamamen genişletilmiş emin olun ekler ve sıvı onları kapsayan üst serebellar dilimleri yerleştirin (insert ortalama 1-3) emin olun medyanın üstüne yerleştirin. Gerekirse medya aşan aspire edin. 37 inkübe ° C ve% 5 CO 2 kültür ortamı her 2 ya da 3 gün değişiyor. Kullanılan orta dilim kaynaklı hücre sağkalım için önemli olan trofik faktörler içerir, çünkü bir seferde orta (örneğin ½ hacmi) yalnızca bir bölümünü değiştirmek için en iyisidir.
2. Sülfüroz Tedavi ve Serebellar Dilimleri boyanması:
- Apoptotik meydan deneme için, öncelikle kültür, in vitro 3 (DIV3) günü medya değişen 5 gün dilimleri . DIV5 kültürleri hücre ölümü temiz bir arka plan ortam değişiklikleri beri sahip olmak için doğrudan medyaya ekleyerek Fas agonist antikoru Jo2 0.5 mikrogram / ml ile tedavi edilir kültürlerde bazı ölüm neden olabilir. Kuyuların yarısı kontrol grubu olarak tedavi edilmezse.
- 24 saat emme ekler altındaki medya kaldırdıktan sonra. Dilimleri düzeltmek için, altındaki buz gibi% 4 PFA 1 ml ve 1 ml eklemek yukarıda ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- 10 dakika PFA kaldırın ve kısa bir süre soğuk PBS ile yıkama sonra.
- Sonraki PBS çıkartın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe PBS ve% 20 buz metanol eklemek üzerinde 1 ml altında ve 1 ml ekleyin.
- PBS ile tekrar yıkayın ve altına 1 ml ve üzerinde 1 ml Triton X-100 PBS içinde% 0,5 permeabilization ekleme ekleyin. 4 en az 12 saat inkübe ° C.
- Permeabilization sonra, en az PBS içinde% 20 BSA ile bloke4 saat oda sıcaklığında ya da geceleme 4 ° C Bu aşamada, dilim, en az 3 gün, 4 ° C engelleme çözüm tutulabilir
- Dilimleri dikkatle serebellar dilim bağlı eklemek membran parça kesme ve PBS içeren 24 kuyucuğu transfer leke için.
- Immün TUNEL reaktif ile ilk bir saat ve Calbidin antikor ile bir gecede, sırayla yapılır.
- PBS aspire edin ve her dilim tüm yüzeyini kaplayan emin TUNEL reaktif 250 mcL ekleyin. Karanlık bir saat için 37 ° C'de inkübe edin.
- TUNEL karışımı kaldırmak ve bir saat 10 dakika PBS ile üç defa yıkamak sonra.
- Son yıkamadan sonra, PBS kaldırmak ve 1 / 1000 PBS içinde Calbindin antikor seyreltme 250 mcL ekleyin ve 4 gece boyunca inkübe ° C de karanlıkta.
- Birincil antikor çözüm çıkarın ve 10 dakika PBS ile üç kez yıkayın.
- Ikincil antikor ekle 250 mcL karanlıkta oda sıcaklığında en az üç saat süreyle inkübe PBS ve 1 / 500 sulandırılmış. TUNEL kiti kullanılan TMR kırmızı etiketli bu nedenle Calbindin için sekonder antikoru Alexa-488 ile konjuge olur.
- PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve dilim DAPI içeren bir montaj medya kullanarak cam bir mikroskop lamı üzerine monte.
- Sırasıyla 488 nm ve 561 nm eksitasyon dalga boyu Calbindin ve TUNEL kullanarak konfokal mikroskop ile resim dilimleri.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Bu protokolün temel zorluk, bizim son okuma hücre ölümü olacaktır, özellikle de sağlıklı serebellar dilim kültürlerini oluşturmak için muktedir. Sağlıklı bir kültür, bir hücre gövdesi katmanı saydam olarak görünür ve mikroskop altında beyincik (Şekil 1) yapraklanmış yapısını görmenizi sağlar. Kültür Birkaç gün sonra dilimleri ince ve non-nöronal hücrelerin başlar dilim marjları uzak göç görülebilir. Kültür birkaç gün sonra dilimleri kapsayan koyu renkli yuvarlak hücreler (büyük olasılıkla makrofajlar), sonunda 10-14 gün sonra, in vitro (Şekil 2) 5 sayısı azalacak. Dilim canlılığı için nihai kanıtı Purkinje hücreleri gibi Calbindin gibi farklı hücresel belirteçleri, leke. Şekil 3 Purkinje hücre tabakasının çeşitli TUNEL pozitif çekirdeklerin bir temsilcisi konfokal mikroskop görüntü gösterir.
Bazı dilim apoptotik uyaran aldı bile, onlar sadece 24 saat açık olduğunu göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu TUNEL boyama ile ölmekte olan hücrelerin DNA parçalanması gözlemlemek için yeterli zaman izin verilir, ancak belirli bir Purkinje hücre tabakası hala mevcut.
Şekil 1. DIV2 Sağlıklı serebellar dilim Bu görüntü, saydam hücre gövdesi tabaka ve sağlıklı bir dilim yapraklanmış serebellar yapı gösterir .
Şekil 2. DIV 7 Sağlıklı serebellar dilim Bu resimde biz hala serebellum ve karanlık bir hücreye organları görünümünü yapraklanmış yapısı izleyebilirsiniz.
Şekil 3. Fas tedavi serebellar dilim Temsilcisi görüntü konfokal Bu görüntü Calbindin (yeşil) ve TUNEL boyama (kırmızı) için pozitif apoptotik hücreleri ile boyandı Purkinje hücreleri gösterir. Purkinje hücreleri tek bir satır görünmüyor ama Folium gibi bir yapı oluşturan kümelenmiş.
Discussion
Bu yöntem, nöronal Organotipik kültürlerin birçok olası uygulamalar biri açıklar ve yabani tip ve mutant serebellar dilim apoptotik uyaranların etkisini araştırmak için izin verdi.
Bu deneyin en önemli parçası, sürekli olarak sağlıklı serebellar dilim kültürü oluşturmak mümkün olmaktır. Önemli faktörler diseksiyon ve dilimleme tekniği ve mümkün olan en kısa zamanda protokol gerçekleştirme yeteneği, ama aynı zamanda dikkatli dilim zarar görmemesi için. Bir diğer önemli faktör, kültür ortamının hazırlanması ve kompozisyon, bu kültürlerin çok hassastır, bu yüzden biz, medyanın çeşitli yemek tarifleri ve markalar denemek zorunda kaldık. , Serum veya medya herhangi bir diğer bileşenler bile farklı partiler dilim canlılığı etkileyebilir. Biz Invitrogen Lot # 480.116 At Serumu ile en iyi sonuçları var.
Serebellar dilim sonra bir serebellar gelişim, elektrofizyoloji, hücre yaşamını tek başına veya apoptotik uyaranlara eksitotoksisitesi veya oksijensizlik yanıt olarak eğitim görebilirsiniz. Yabani tip ve mutant serebellar dilimleri kullanarak karşılaştırmalı çalışmalar serebellar fonksiyon ve gelişiminin pek çok açıdan çok anlayışlı edilmiştir.
Disclosures
IACUC tarafından belirlenen politikalara uygun olarak yapılan tüm hayvan çalışmaları yapıldı. Salk Enstitüsü'nden AAALAC akredite bir tesistir.
Acknowledgments
Bu çalışmada IPSEN Vakfı tarafından finanse edildi. IMV, Moleküler Biyoloji Amerikan Kanser Derneği Profesörü ve Örnek Yaşam Bilimleri Irwin ve Joan Jacobs Başkanı tutar. Bu çalışma NIH, Leducq Vakfı, Meriaux Vakfı, Ellison Tıp Vakfı, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostat Kanseri Vakfı, HN ve Frances C. Berger Vakfı hibe kısmen desteklenmiştir. PAS Nörobilim ve Uyuşturucu (R01 DA019022) Ulusal Enstitüsü McKnight Endowment Fund tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar Mark Schmitt teşekkür etmek istiyorum. Grafik sanat, Murat T. Simon tarafından dizayn edilmiştir. Sponsorluk nazik Invitrogen tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
