脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

Summary

新生児げっ歯類の脊髄の電気生理学的記録を測定するために使用される細胞外吸引電極の製造と使用のデモンストレーション

Abstract

神経回路をと運動の発展は、新生児げっ歯類の脊髄中枢パターン発生器（CPG）の動作を用いて研究することができます。我々は解剖さ齧歯類の脊髄では、CPGの活動を調べるために使用される吸引電極を作製する方法、または虚構の運動を示しています。齧歯類の脊髄は、人工脳脊髄液に配置され、腹根を吸引電極に描かれています。電極は、市販の吸引電極を変更することによって構成される。重い銀線は、市販の電極によって与えられた標準的なワイヤーの代わりに使用されます。商業用電極上にガラスチップは耐久性を高めるためのプラスチックの先端に置き換えられます。私たちは、一貫性と再現性を可能にする、チューブの特定のサイズで作られた手描きの電極と電極を準備する。データは、アンプと神経像集録ソフトウェアを使用して収集されます。録音は、それぞれ、機械的および電気的干渉を防ぐために、ファラデーケージ内の空気のテーブル上で実行されます。

Protocol

分離された脊髄の電気生理学的記録は、神経回路を¹に遺伝と発達的変化を明らかにすることができます。我々は以前に新生児マウス脊髄^2を分析する方法を示した。ここでは、孤立した脊髄³の虚構の移動を記録するのに役立ちます吸引電極を準備する方法を提示する。

プラスチックチューブの電極の先端は、低温アルコールランプ^3-5を使用して、手で非常に微細な先端に描画することができます。プラスチックチューブ（PE90、クレイアダムスIntramedic ^TM）は、可鍛性フォームにチューブを柔らかくするために火炎にわたって開催される。チューブは、溶融し始め、それが熱源から削除され、両端が静かに離れて引かれるより半透明になりますように。炎からチューブを取り外すのタイミングは、プラスチックが崩壊または描画されている間に分割していない保証することが重要です。チューブの薄い部分は、試料や脊髄の分節レベルの年齢によって決まる、希望の内径に応じてカミソリの刃で切断されています。チューブにOリングを置くことを容易にするため、45 °のカットは、カミソリの刃を持つチューブの厚さの終わりに行われます。フェルールとO -リングは、電極のバレルに電極チップを接続する太い側にインストールされます。

特にサイズの電極を可能にすると手引っ張って電極チップの難しさを避けるために、電極が厚いチューブ（PE90）に挿入された小型のチューブを使用して構築することができます。チューブの長さは、録画設定の要件に固有のもので、可変です。私たちは、実験^1-3,5で使用される測定値を提示する。 PTFEファインチューブ（ゼウス、小さな部品）とPE90チューブの10cmの長さの1cm長さは、カミソリの刃でカットされます。小さなチューブの端面は、それらが破砕または閉じていないを確認するために調べる必要があります。彼らは昆虫ピン（ファイン科学のツール）を使用して開くことができます。接着剤（JBウェルド）の低下は、PTFEチューブの中間点に配置されます。 PTFEチューブと接着剤は、PE90チューブの口の吸引を使用してPE90チューブに描かれています。 45 °のカットは、チューブやフェルールとO -リングの厚さの終わりに行われるように以前、添付されています。

フェルールとBNCコネクタは、市販の吸引電極からねじを緩めるされています。 BNCコネクタは、ワックスのシールを除去するために一時間キシレンに浸漬される。コネクタは、その後水で洗浄し、乾燥させる。

低角度側のポートは、バレルの側で行う必要があります。金属棒は、ブンゼンバーナーを用いて加熱し、低角度で鏡筒の側面上の既存の穴に押し込まれる。 0.010インチ銀線（AMシステム）の15センチメートル長さは15分間カットや漂白剤に浸漬される。これは、信号の伝導⁶に助けることが塩化銀の皮膜を作成するために行われます。ワイヤは、水ですすぎ、乾燥して、BNCコネクタにハンダ付けされています。 BNCコネクタと銀線は、バレルの側に残るためにBNCコネクタのための十分な余地を吸引電極のバレルに挿入されます。吸引チューブは、サイドポート2〜3センチメートルに挿入されます。シリコーンシーリング材は、約2〜3センチメートルバレルに注入されます。 BNCコネクタは、前方にシール剤を押して電極のバレルにスレッド化されている。

電極の先端は、現在電極のフロントエンドにスレッド化されている。収縮チューブは、サイドポートから吸引ラインを強化するために追加することができます。

電極はマグネットスタンドに接続されているマイクロマニピュレータに搭載されており、記録の皿の近くに配置されます。 BNC同軸ケーブルは、アンプに配線されているヘッドステージに接続されています。アンプは、データ収集ソフトウェア（Polyview）とPCのコンピュータにデジタルカードにアナログ（ナショナルインスツルメンツ）に接続されているアダプタ（Polyview）に接続されています。

電気生理学的データを記録するとき、それはすべての外部の干渉を排除する必要があります。録音皿、アンプ、およびヘッドステージはそれぞれ、電気的、機械的干渉を防ぐためにファラデーケージ内の空気のテーブルの上に置かれている。

代表的な結果：

図1。市販の吸引電極は重いゲージの銀線と手のアルコールランプに描かれた、または特定のサイズの市販のプラスチック製のチューブで構成されているプラスチック製の先端を追加することによって変更することができます。さらに、パラフィンシーラントは、より耐久性のあるシリコンコーキングシール剤に置き換えられます。

図2エアテーブルとの関係で吸引電極の概略図（機械的分離用）、ファラデーケージ（電気isolati）で、アンプとコンピュータ。それは記録の皿とエアテーブルとファラデーケージに参照される第2のグランドを基準とする地盤があることに留意すべきである。

Discussion

神経系の発達は、単離されたげっ歯類の脊髄を用いて研究することができます。神経伝達物質の存在下では、架空の運動は、パターニングされた電気的活動^1,3の形で脊髄から生成することができます。これらのリズミカルなバーストは0.2から0.5 Hzで生産され、左、右と屈筋、伸筋交替にパターニングされています。異なる発達段階で、この活動の頑健性やパターンが¹変化する。遺伝的変異はまた、この活動^3,5,7のパターン形成を妨げることができる。この活動のトランスジェニックと発達の研究では、中枢パターン生成回路の構成についての洞察を提供し、一般的に、神経発生の研究を通知する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing)	Zeus	36AWG	0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006”
Large tubing (0.86mm (0.34”))	BD Biosciences	427420	0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”)
Electrode Barrel	A-M Systems	573000
Adhesive	JB Weld
Adhesive: Silicone caulk
Solder and soldering iron
Bleach
Xylene
Silver wire: 0.010”	A-M Systems
Insect pins: Austerlitz 0.1mm	Fine Science Tools	26002-10
Magnetic Stand	Narishige International	GJ-8
Micromanipulator	Narishige International	MN 151
Miniboard (Headstage)	Grass Technologies	F-15EB/B1
Polyview Adaptor Unit	Grass Technologies	PVA 8
Bipolar Portable Physiodata Amplifier System	Grass Technologies	15LT
ANALOG TO DIGITAL CARD	National Instruments	6035E
Air Table; Vibraplane	Kinetic Systems