Summary
A demonstração da fabricação e uso de um eletrodo de sucção extracelular usado para medir gravações eletrofisiológicas de cordas de roedores neonatal espinhal
Abstract
Desenvolvimento de circuitos neurais e locomoção podem ser estudadas usando neonatal da medula espinhal de roedores centro gerador de padrão de comportamento (CPG). Demonstramos um método para fabricar eletrodos de sucção que são usados para examinar a atividade CPG, ou locomoção fictícia, em cabos de roedores dissecados espinhal. Os cabos de roedor da coluna vertebral são colocados no líquido cefalorraquidiano artificial e as raízes ventral são atraídos para o eletrodo de sucção. O eletrodo é construído através da modificação de um eletrodo de sucção disponível comercialmente. Um fio mais pesado de prata é usado em vez do fio padrão dado pelo eletrodo disponíveis comercialmente. A ponta do eletrodo de vidro em comercial é substituído com uma ponta de plástico para maior durabilidade. Nós preparamos mão eletrodos desenhado e eletrodos feitos de tamanhos específicos de tubos, permitindo a consistência e reprodutibilidade. Os dados são coletados por meio de um amplificador e software de aquisição neurograma. As gravações são realizadas em uma mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday para evitar interferências mecânicas e elétricas, respectivamente.
Protocol
Gravações eletrofisiológicas de isolados medula espinhal pode revelar mudanças genéticas e de desenvolvimento de um circuito neural. Nós já demonstraram um método para dissecar os cabos do mouse neonatal da coluna vertebral 2. Aqui apresentamos um método para preparar eletrodos de sucção útil na gravação de locomoção fictícia na medula espinhal isolado 3.
A ponta de um eletrodo de tubos de plástico podem ser atraídos para uma ponta muito fina à mão usando uma lâmpada de álcool a baixas temperaturas 3-5. O tubo de plástico (PE90, Clay Adams Intramedic TM) é realizada sobre a chama para suavizar o tubo em uma forma maleável. Como o tubo começa a derreter e se torna mais transparente ele é removido da fonte de calor e as extremidades são delicadamente separados. O momento de retirar o tubo da chama é importante para garantir o plástico não colapso ou dividir, enquanto sendo desenhado. A porção fina do tubo é cortado com uma lâmina de barbear de acordo com o diâmetro desejado interna, como ditado pela idade do espécime ou o nível segmentar da medula. Para facilitar a colocação de um o-ring no tubo, um corte de 45 ° é feita no final de espessura da tubulação com uma lâmina de barbear. A ponteira e o-ring são instalados na extremidade grossa para prender a ponta do eletrodo para o barril do eletrodo.
Para permitir especificamente eletrodos de tamanho e evitar as dificuldades de mão-de puxar dicas eletrodo, eletrodos podem ser construídas usando tubos de pequeno inserido em um grosso tubo (PE90). Os comprimentos dos tubos são específicos para os requisitos da configuração de gravação e são variáveis. Nós apresentamos as medidas utilizadas em nossos experimentos 1-3,5. Um comprimento 1cm de PTFE tubo fino (Zeus, peças pequenas) e um comprimento de 10 cm de tubos PE90 são cortados com uma lâmina de barbear. As extremidades do tubo de pequeno porte devem ser examinados para ter certeza de que eles não são esmagados ou fechada. Eles podem ser abertos com um pino de insetos (Ferramentas Ciência Fine). Uma gota de adesivo (JB Weld) é colocado no ponto médio do tubo de PTFE. A tubagem de PTFE e adesivo são atraídos para a tubulação de sucção PE90 usando boca no tubo PE90. Um corte de 45 ° é feita no final de espessura da tubulação e uma ponteira e o-ring são fixos, como anterior.
O conector BNC e ponteira são desaparafusado a partir de um eletrodo de sucção comerciais. O conector BNC é embebido em xilol por uma hora para remover o lacre de cera. O conector é então lavado com água e seca.
Uma porta lateral inferior em ângulo deve ser feita no lado do barril. Uma haste de metal é aquecido através de um bico de Bunsen e pressionado para dentro do buraco existente na lateral do barril em um ângulo baixo. Um comprimento 15 centímetros de fio de prata 0,010 polegadas (AM Systems) é cortado e embebido em lixívia para 15 minutos. Isto é feito para criar um revestimento de cloreto de prata que ajuda na condução de sinal 6. O fio é lavado com água, secos, e então soldada no conector BNC. O fio conector BNC e prata são inseridos no barril eletrodo de sucção com espaço suficiente para o conector BNC para permanecer ao lado do barril. Tubo de sucção é inserido na porta lateral 2-3cm. Selante de silicone é injetado dentro do cano de aproximadamente 2-3cm. O conector BNC é enfiada para o barril do eletrodo empurrando o selante para a frente.
A ponta do eletrodo está agora inserido no front end do eletrodo. Tubulação do psiquiatra também pode ser adicionado para reforçar a linha de sucção da porta lateral.
Eletrodos são montados em micromanipuladores que estão ligados ao descanso magnético, e colocado perto do prato de gravação. BNC cabos coaxiais são conectados a um headstage que é ligado a um amplificador. O amplificador é conectado a um adaptador (PolyView) que é conectado a uma placa de analógico para digital (National Instruments) em um computador PC com software de aquisição de dados (PolyView).
Ao gravar dados eletrofisiológicos, é necessário eliminar todas as interferências externas. O prato de gravação, amplificador, e palco de cabeça são colocados em uma mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday para evitar interferências elétricas e mecânicas, respectivamente.
Resultados representativos:
Figura 1. Um eletrodo de sucção comercialmente disponíveis podem ser modificadas pela adição de um fio de prata calibre mais pesado e uma ponta de plástico que é desenhado à mão sobre uma lâmpada de álcool, ou construídas com tubos de plástico disponível comercialmente de tamanhos específicos. Além disso, o selante de parafina é substituída com mais duráveis selante de silicone calafetar.
Figura 2. Um esquema do eletrodo de sucção em relação à mesa de ar (para isolamento mecânico), gaiola de Faraday (elétrica isolation), amplificador e computador. Deve-se notar que há um terreno referenciado para o prato de gravação e um segundo motivo que é referenciado para a mesa de ar e gaiola de Faraday.
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Discussion
Desenvolvimento do sistema nervoso podem ser estudadas usando cabos isolados de roedores espinhal. Na presença de neurotransmissores, locomoção fictícia pode ser gerada a partir da medula espinhal na forma de padrões de atividade elétrica 1,3. Estas explosões rítmicas são produzidos em 0,2-0,5 Hz e são estampados em alternâncias esquerda-direita e flexores e extensores. Em diferentes estágios de desenvolvimento, a robustez e os padrões dessa atividade varia 1. Mutações genéticas também podem perturbar a padronização dessa atividade 3,5,7. Estudos transgênicos e de desenvolvimento desta atividade fornecer insights sobre a organização do circuito padrão central de geração e informar os estudos de desenvolvimento neural, em geral.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff é professor no Laboratório de Expressão Gênica do Instituto Salk para Estudos Biológicos e um investigador no Instituto Médico Howard Hughes. Este trabalho foi financiado pelo Christopher Reeve e Dana Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker e Mike Sullivan em Recursos Multimídia do Instituto Salk prestou assistência com a fotografia e edição.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
